北细辛不同部位内生真菌的多样性与抑菌活性

史启今， 姜 丹， 周 娜， 王潇晗， 刘春生

(北京中医药大学 中药学院，北京 102488)

细辛为马兜铃科细辛属植物，主要包括北细辛[AsarumheterotropoidesFr. Schmidt var.mandshuricum(Maxim.) Kitag.](以下简称为A.heterotropoldes)、汉城细辛(AsarumsieboldiiMiq. var.seoulenseNakai)和华细辛(AsarumsieboldiiMiq.)，其干燥根和根茎具有解表散寒、祛风止痛、通窍、温肺化饮等功效[1]。其中北细辛质量最优，为市场的主流品种[2]。药用植物的大部分次生代谢产物具有药用价值，是衡量中药品质的关键指标[3]，因此关键次生代谢产物含量高的品种在中药材栽培中备受关注。植物内生真菌(endophytic fungi)生活在健康植物各组织器官的细胞间隙或细胞内部，是植物微生态系统的重要组成部分[4]，在长期协同进化过程中与宿主植物形成了互惠共生关系。国内外研究表明，药用植物内生真菌具有提高药用植物胁迫抗性[5-6]、促进宿主对有机养分的吸收[7]、促进宿主对矿质营养的吸收[8]、促进药用植物次生代谢产物的积累[9-10]等生物学功能。1996年，Strobel等[11]从西藏红豆杉中分离出第一株产生紫杉醇的内生真菌小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)，这一发现突破了紫杉醇提取受植物资源限制的瓶颈。由于能够产生有效成分相关次生代谢产物的内生放线菌和内生细菌较少，使得越来越多的学者关注药用植物内生真菌的研究[12]。因此，中药来源的内生真菌在活性天然产物的开发和获取方面具有重要价值[13]。药用植物不同部位内生真菌的相关研究较多。李弘琨[14]对东北红豆杉紫杉烷类化合物与内生真菌之间的相关性进行评估，结果表明内生真菌在不同部位紫杉烷差异代谢形成中具有一定作用。竺俊鑫等[15]研究了红豆杉不同部位在内生真菌分离效率以及产紫杉醇菌株筛选率方面的规律性，结果表明与茎、叶分离的内生真菌相比，根部分离产紫杉醇的内生真菌，无论菌株数量还是紫杉醇含量均具有明显优势。可见内生真菌与中药植物次生代谢产物的分布有着密切联系，而北细辛内生真菌的研究相对较少，主要集中在化学成分[16-17]、药理作用[16-17]、品质鉴别[18]、栽培管理[19-20]、组织培养等方面[21]，对其分离菌种多样性的研究更是鲜有报道。细辛提取液对大肠埃希菌(Escherichiacoli)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)均有明显的抑制作用[22]，而细辛内生真菌的抑菌活性研究未见报道。因此，本研究对北细辛不同部位的内生真菌进行了分离、鉴定，分析其群落多样性，并评估抑菌活性。以期为北细辛内生真菌的资源利用和开发提供基础，并为进一步研究内生真菌对细辛药材质量的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 5年生北细辛于2020年4月采自辽宁省抚顺市清原满族自治县高家沟，挖取后移栽至实验专用花盆中进行常规培育，选取未伤及根部植株作为试验材料。试验材料经北京中医药大学中药学院刘春生教授依据其外部形态鉴定为北细辛(Asarumheterotropoldes)。

1.1.2 抗菌活性供试菌株 大肠埃希菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)均为北京中医药大学中药学院分子生药学实验室保存菌种。

1.1.3 培养基 ①内生真菌分离培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：取200 g去皮的土豆切成约1 cm3小块，加入去离子水煮沸30 min；8层纱布过滤，向滤液中加入琼脂18 g，葡萄糖20 g，蒸馏水定容至1 L。②LB液体培养基：在450 mL去离子水中分别加入氯化钠5 g、酵母提取物2.5 g和胰蛋白胨5 g，去离子水定容至500 mL，调节pH值至7.0。

1.1.4 主要仪器与设备 立式压力蒸汽灭菌器(LS-B35，江阴滨江医疗设备厂)；洁净工作台(SW-CJ-1D，江苏苏州苏洁净化设备厂)；立式恒温振荡培养箱(HZQ-F100，北京东联哈尔滨仪器制造有限公司)；混合冷冻球磨仪(MM400，RETSCH，德国)；水平电泳槽(JY-SP3，北京君意东方电泳设备有限公司)；凝胶成像系统(GelDoc 2000，BIO-RAD，美国)；光学显微镜(XSP-44X.9，上海光学仪器一厂)；梯度PCR仪(Veriti 96，Thermo Fisher Scientific，美国)。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 先去除新鲜北细辛植株根部的大块泥沙，再用流动的自来水冲洗植物材料1 h以上，然后用手术剪将处理后的北细辛不同部位分离，最后用滤纸吸干水分，备用。

1.2.2 内生真菌分离纯化与保存 在超净工作台中，用0.1%升汞和75%乙醇对北细辛地下部分进行表面消毒。表面消毒方法：先用0.1%升汞消毒12 min，无菌水漂洗3～5次(约2 min)；再用75%乙醇消毒45 ～ 60 s，无菌水漂洗5 min；最后用无菌滤纸吸干表面水分。将根切成长约0.5 cm的组织块，根状茎切成约0.3 cm3的组织块，越冬芽切成约0.2 cm3的组织块，并将组织块表面轻轻划伤，置于PDA培养基平皿中，每皿3～ 5块。采用组织印迹法和漂洗液检测法作为对照处理[23]，以验证表面消毒是否彻底。将接种组织块的培养基置于28 ℃恒温培养箱中倒置暗培养3～7 d。采用菌丝尖端纯化法，挑取组织块表面新生的菌丝接种于新的PDA培养基中，反复分离纯化直至形成单一菌落。采用PDA斜面试管和甘油冻存法进行内生真菌保存[24]。

1.2.3 内生真菌的形态学和显微学鉴定 形态鉴定：观察并记录PDA平皿中菌落的直径、颜色、形态等宏观特征。显微鉴定：在无菌载玻片中央滴加1滴乳酸酚棉蓝染色液，用解剖针挑取少量菌丝，混匀染色30 s，加入一滴甘油，盖上盖玻片并轻轻压片，光学显微镜下观察真菌的孢子结构、菌丝特征、有无横隔并进行拍照。参考《真菌鉴定手册》[25]、《中国真菌志》[26]等，初步鉴定内生真菌。

1.2.4 内生真菌的分子鉴定 利用真菌基因组DNA提取试剂盒提取内生真菌基因组DNA。采用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增反应。引物序列：ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR扩增体系：2×EasyTaq® PCR SuperMix (+dye ) 15 μL，DNA模板1 μL，ITS1和ITS4各1 μL，ddH2O 12 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min(30个循环)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，回收产物送至擎科生物股份有限公司进行测序。利用ContigExpress9.10软件对测序结果进行拼接，将拼接序列在NCBI数据库中进行BLAST比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。利用软件MEGA5.0进行聚类分析，应用邻接法(Neighbor- joining，NJ)构建系统进化树，kimura 2- parameter model计算进化距离，1 000次重复检验发育树的可靠性。

1.2.6 抑菌活性初筛 采用菌饼法进行初筛，用LB培养基培养各试验用细菌菌株菌悬液至OD600 nm=0.6 ～ 0.8，均匀涂布于平板培养基上，并切去直径大小为6 mm的圆形琼脂块，然后在被测试真菌培养物上切取直径大小为6 mm的圆形菌饼，填补在已涂布好细菌菌株的平板培养基上，28 ℃培养48 h后，测量抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 北细辛内生真菌的形态学鉴定

统计每株内生真菌的菌落形态特征和菌丝体显微特征，其中菌株G 3-7-12、G 1-8-1、G 1-97-2、G 4-10-1、G 3-3、G 3-8、G 3-7-3的统计结果见图1、表1，分离所得菌株在颜色、表面纹饰、菌丝粗细、孢子形态等方面差异显著。

2.2 北细辛内生真菌的分子鉴定

利用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)数据库BLAST比对rDNA ITS的测序拼接结果，下载相似度最高的菌株序列，构建系统进化树分析亲缘和进化关系，部分菌株的分子鉴定结果见表2、图2。G 3-7-3与Ilyonectriarobusta在同一个分支内，序列相似性为99.81%，G 1-8-1与Aspergillusterreus在同一个分支内，序列相似性为100%，G 3-17-2与Talaromycesstollii在同一个分支内，序列相似性为99.32%，G 4-10-1与Aspergillusfumigatus在同一个分支内，序列相似性为99.83%，G 3-3与Aspergillustransmontanensis在同一个分支内，序列相似性为99.49%，G 1-97-2与Cladosporiumverrucocladosporioides在同一个分支内，序列相似性为100%，G 3-8与Sistotremabrinkmannii在同一个分支内，序列相似性为99.84%。

图1 北细辛部分内生真菌菌落形态特征及显微学观察Fig.1 Morphological characteristics and microscopic observation of some endophytic fungi in A. heterotropoldesa：菌落正面；b：菌落背面；c：分生孢子梗的显微特征；d：分生孢子的显微特征a：Front of colony；b：Back of colony；c：Microscopic characteristics of conidiophores；d:Microcopic chaacteristic of conidia

表1 北细辛部分内生真菌菌落形态特征及显微学观察结果

图2 北细辛部分内生真菌与同源菌株的聚类分析Fig.2 Cluster Analysis of some endophytic fungi and homologous strains of A. heterotropoldes黑色加粗字体表示本研究中分离的内生真菌编号The black bold indicates the number of endophytic fungi isolated in this study

表2 北细辛部分内生真菌的同源菌株信息

2.3 北细辛不同部位内生真菌的多样性分析

本研究从北细辛的3种不同部位分别取50个(根)、50个(根状茎)、20个(越冬芽)组织块，分别分离得到54株、59株和4株内生真菌，共计117株，其中97株归属为6纲6目8科9属17种(表3)。从北细辛根中分离得到54株内生真菌，分别归属为9个属，其中土赤壳属(Ilyonectria,31.48%)为优势菌属，其次是青霉属(Penicillium,7.41%)；从根状茎中分离得到59株内生真菌，归属为2个属，分别是刺盘孢属(Colletotrichum,57.63%)、茎点霉属(Phoma,37.29%)；从越冬芽中分离得到4株内生真菌，均归属为茎点霉属。综合本研究结果可以得出，刺盘孢属(32.48%)为北细辛内生真菌的优势菌属，其次是茎点霉属(23.93%)、土赤壳属(14.53%)；曲霉属(Aspergillus,2.58%)、Sistotrema(0.85%)、木霉属(Trichoderma,0.85%)、枝孢属(Gladaxporism,0.85%)和镰孢属(Fusarium,0.85%)内生真菌均为稀有菌属，结果分别见表4、图3。

表3 北细辛不同部位内生真菌的分类结果

表4 北细辛不同部位内生真菌的相对频率

图3 北细辛不同部位内生真菌(属)的比例Fig.3 The proportion of endophytic fungi (genera) in different parts of A. heterotropoldes

在北细辛根部分离9种特有菌株Sistotremabrinkmannii、Trichodermascalesiae、Talaromycesfuniculosus、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、Cladosporiumverrucocladosporioides、强壮土赤壳(Ilyonectriarobusta)、土曲霉(Aspergillusterreus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、Aspergillustransmontanensis；在根状茎中分离3种特有菌株Paraboeremiaselaginellae、胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、博宁炭疽菌(Colletotrichumboninense)；在越冬芽中分离1种特有菌株Paraboeremiaputaminum(图4)。多样性分析结果见表5，IR用于衡量3个不同部位北细辛内生真菌的丰富度和每个组织块受多重侵染的频率，3个不同部位北细辛内生真菌的分离率为108%(根)、118%(根状茎)和20%(越冬芽)；多样性指数H′用于比较3种不同部位北细辛内生真菌的物种多样性程度，其中根部内生真菌的多样性指数最高，多样性指数为1.80，根状茎次之，多样性指数为1.54，越冬芽最低，多样性指数为0.56；Cs用于比较3种不同部位北细辛内生真菌种类的相似程度，其中根和根状茎内生真菌的种类相似度最高，Cs为0.31，根和越冬芽内生真菌的Cs为0.14，根状茎和越冬芽内生真菌的Cs为0.22。

图4 北细辛不同部位内生真菌菌种的Venn图Fig.4 Venn diagram of endophytic fungi in different parts of A. heterotropoldes

表5 北细辛不同部位中内生真菌的多样性

2.4 抑菌活性初筛

研究结果发现6株真菌均有一定的潜在抑菌活性。其中G 3-3、G 4-10-1、G 2-2-1、GZJ 2-12-2均对金黄色葡萄球菌有抑制作用，GZJ 2-12-2对大肠埃希菌有抑制作用，G 3-3、G 2-2-1、GZJ 2-12-2、GZJ 1-6、G 3-8对枯草芽胞杆菌有抑制作用。GZJ 2-12-2对三种细菌均有抑制作用(表6、图5)。

表6 北细辛内生真菌对三种指示菌的抑菌圈直径

图5 部分内生真菌对三种细菌的抑制作用Fig.5 The inhibiting effects of partial endophytic fungi on three types of bacteriaA～C:对枯草芽胞杆菌的抑制作用；D、E:对金黄色葡萄球菌的抑制作用；F:对大肠埃希菌的抑制作用；a:G 2-2-1；b:G 3-3；c:GZJ 1-6；d:GZJ 2-12-2；e:G 3-8；f:G 4-10-1A-C: the inhibiting effects on Bacillus subtilis；D,E: the inhibiting effects on Staphylococcus aureus；F: the inhibiting effects on Escherichia coli；a:G 2-2-1；b:G 3-3；c:GZJ 1-6；d:GZJ 2-12-2；e:G 3-8；f:G 4-10-1

3 讨 论

本研究共获得117株北细辛内生真菌，其中97株归属于6纲6目8科9属17种，茎点霉属为3个部位内生真菌共有属。北细辛不同部位可培养内生真菌具有多样性，根、根状茎、越冬芽三个部位内生真菌的数量、组成及种群间存在差异，其刺盘孢属是北细辛内生真菌的优势菌属，在根状茎和根中均有分布。包丽霞等[27]曾对四川和陕西产地的北细辛内生真菌进行分离鉴定，并对其代谢产物的生物活性进行研究，分离出的内生真菌归属于小丛壳属2株、镰孢属2株、刺盘孢属1株，这与本研究结果相似。本研究在北细辛中分离出的Sistotrema、木霉属、青霉属、土赤壳属、茎点霉属、曲霉属内生真菌均为首次在中国地区北细辛中分离得到。这可能是药用植物内生真菌具有地域分布差异性导致的[28]，本研究试验材料采自北细辛道地产区辽宁省抚顺市，实验结果为进一步研究内生真菌对细辛药材质量的影响提供新的思路，也为药用植物内生微生物的资源利用和开发提供参考。

目前，抗菌活性是内生真菌及其活性代谢物研究中被挖掘较多的一个方面，研究人员通过大量的体外抗菌实验表明，约30%的内生真菌次生代谢产物具有抗菌活性[29]。近年来，化学类抗菌药物的过度使用和环境污染等因素导致病原微生物产生耐药性，进而影响植物的正常发育和生长。从微生物中寻找更绿色、环保的抗菌药物和生防菌剂可以有效应对此类问题。本研究以三种常见细菌为供试菌，进行抑菌试验，发现细辛提取液的相关研究结果[22]与本研究中GZJ 2-12-2的抑菌作用一致，该菌株分离自北细辛根状茎，经鉴定为茎点霉属(Paraboeremialitseae)，其对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌均有抑制作用，由此可见，茎点霉属内生真菌可能是北细辛抑制这三种菌的关键内生真菌。此外，G 3-3、G 2-2-1、GZJ 2-12-2对金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌有抑制作用，G 4-10-1对金黄色葡萄球菌有抑制作用，GZJ 1-6、G 3-8对枯草芽胞杆菌有抑制作用。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌为人体的常见致病菌。枯草芽胞杆菌在植物病害防治等方面展现了优良的特性[30]，一般被认为是非致病菌，但也有少数报道表明对于恶性肿瘤、艾滋病、免疫功能抑制、粒细胞减少症等病症的患者来说，枯草芽胞杆菌依然具有致病性[31]。对具有抑菌活性的菌株还有待进一步深入研究，以拓宽药用和生防资源。