茯苓太空诱变菌株生物特性与品质系统研究

刘晓柳， 钟 灿， 谢 景， 侯凤飞， 戴甲木， 陈贵明， 王先有,5， 张水寒， 金 剑*

(1.湖南中医药大学 研究生院，湖南 长沙 410208;2.湖南省中医药研究院 中药研究所，湖南 长沙 410013;3.湖南补天药业股份有限公司，湖南 怀化 410017;4．湖南省茯苓工程技术研究中心，湖南 怀化 410017；5.湖南省靖州苗族侗族自治县茯苓专业协会，湖南 怀化 410017)

茯苓为多孔菌科真菌茯苓(Poriacocos(Schw.) Wolf)的干燥菌核[1]，具有利水渗湿、健脾化痰、宁心安神等多种功效，为多种经典方剂原料，有“十方九苓”之说[2]。现代医学研究表明，茯苓具有抗肿瘤[3]、抗氧化[4]、抗衰老[5]、抗炎[6]、免疫调节[7]等多种药理活性，临床应用价值显著。茯苓栽培利用历史悠久[8]，我国具有保藏号的茯苓菌株近100株，但菌株资源来源混杂，同种异名现象严重[9]。目前，栽培所用茯苓菌株多为菌核分离，长期无性繁殖导致的茯苓菌种退化、产量和质量不稳定等问题成为制约产业化发展的瓶颈[10]。开展茯苓的优良菌株培育创新具有重要意义。近年来，多基因特征序列分析成为菌种鉴定和遗传进化关系分析的有效手段[11-14]。ITS、LSU、TEF1-α基因片段序列分析已在灵芝[15]、冬虫夏草[16]、贝盖侧耳[17]等真菌中开展相关应用。而茯苓研究主要集中在药理和药效上，其基本特性及遗传关系的研究相对较少[18]。同时基于国家新品种保护政策，许多其他药食用菌已成功开展新品种研究[19-20]，而茯苓未有相关报道。通过太空诱变开展种质创新是新品种选育的重要手段[21]。我国已有22个省市参与了航天育种工作，38个品种通过国家审定，80多个品种在大面积推广。湖南省怀化市靖州苗族侗族自治县(靖州县)是“中国茯苓之乡”，一直致力于茯苓的种质创新研究工作。2013年靖州县茯苓专业委员会与国家航天育种研究中心合作，将茯苓“湘靖28”菌株通过神舟十号送上太空，尝试利用太空诱变作用培育出茯苓新品种。本研究基于分子生物技术和大田栽培实验，对搭载“神舟十号”太空诱变选育的茯苓太空10号菌株与目前市场上主流商业应用的茯苓湘靖28、5.78菌株进行比较，探讨太空10号菌株推广应用的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 茯苓菌株和菌核样品 茯苓菌株“太空10号”(PoriacocosStrain Mutagenesis Breeding In Space No.10, MBIS No.10)、“湘靖28”(Poriacocosstrain Xiangjing 28)、“5.78”(Poriacocosstrain 5.78)由湘黔桂食药用菌研究所提供。3个菌株分别按照GAP规范，进行茯苓二级种和三级种传代制种，在云南省普洱市宁洱哈尼族彝族自治县宁洱镇茯苓基地进行栽培，收集新鲜茯苓菌核。

1.1.2 培养基 ①栽培种培养基(质量分数，%)：松木屑78，麸皮20，蔗糖1，石膏粉1，硫酸镁0.2，含水量(60±2)，pH值5.5～6.5。②ZJ固体平板培养基：蛋白胨10 g，葡萄糖15 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母粉2 g，琼脂15 g，去离子水1 000 mL。

1.1.3 主要试剂与仪器设备 DNA提取试剂盒购自北京擎科新业生物技术有限公司，特异性引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成；金牌MIX(包含dNTPTaq酶、缓冲液)购自北京擎科新业生物技术有限公司；无水乙醇(湖南汇虹试剂有限公司 202008191)；茯苓酸购自成都克洛玛生物科技有限公司(批号CHB180727)，茯苓对照药材购自中国检验科学研究院(批号121117-201910)。正置生物显微镜(Leica DM2 500 LED，德国徕卡)；超微量生化分光光度计(ScanDrop 100，德国耶拿)；薄层色谱成像系统(GoodLook-100，上海科哲生化科技有限公司)；PCR仪(AG 22331 Hamburg，德国Eppendorf公司)；冷冻高速离心机(Multifuge X1R,赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；高灵敏度化学发光凝胶成像系统(ChemiDoc XRS+Image LabTM,武汉佰蕾真生物科技有限公司)；智能人工气候箱(RXZ-380，宁波江南仪器厂)；生物冷冻扫描电镜(Cryo-SEM,FEI Quanta 450)。

1.2 方法

1.2.1 菌丝及菌核性状观察 参照《中国药典》2020版茯苓项下观察太空10号茯苓菌核形态。去皮，切取直径1 cm左右新鲜菌核接种于ZJ固体培养基中，30 ℃避光培养10 d，观察菌丝生长表观形态。取少量菌核，干燥、粉碎，过50目筛，牙签蘸取少量粉末制水合氯醛装片，于光学显微镜下观察。用刀片切取新鲜菌核和菌丝样品放置于硅片上，用无水乙醇浸润5～10 s后取出自然干燥，约0.5～1 h后，取样固定在样品台上进行液氮冷冻，制成样品后生物冷冻电镜扫描仪下观察。

1.2.2 拮抗试验 在无菌操作环境下，将茯苓供试菌株用打孔器定量直径1 cm菌块，接种于ZJ培养基平板，接种块间距约30 mm，每个平板接两个不同菌株，共三种组合，每种组合3个重复，30 ℃避光培养7～10 d直至菌丝长满整个平板，观察不同菌株间是否出现拮抗线及拮抗线是否明显[22]。

1.2.3 不同温度下的菌丝生长速度测定 菌丝生长速度测定参照陈兴东等[23]、上官舟建等[24]方法进行。采用打菌块法将3株茯苓菌株用打孔器定量直径1 cm菌块接种于ZJ固体培养基中，分别正置于10、20、30、40 ℃恒温培养箱中培养，每个菌株5个重复，待菌块周围出现新鲜菌丝后，使用十字交叉法每24 h测量菌落直径并记录，直至菌落长满培养皿。

1.2.4 茯苓栽培转化率测定 3株茯苓菌株分别按照GAP规范进行茯苓二级种和三级种传代制种，采用传统种植法种植茯苓。下窖时称量每一窖段木总质量(M)，测产验收时称量每一窖茯苓总质量(m1)，计算总鲜质量与栽种茯苓时所用段木总质量比值，得鲜质量转化率(α1)。切取新鲜茯苓菌核m0(约50 g)，置于60 ℃烘箱中干燥至恒重，称其干重m2得出干质量占比，继而得出每一窖茯苓干质量，计算干质量与所用段木质量即得干质量转化率(α2)。转化率计算公式：

1.2.5 薄层色谱鉴别 参照《中国药典》2020版四部通则0502薄层色谱法试验[25]。取太空10号、湘靖28、5.78茯苓粉末各1 g，加乙醚50 mL，超声处理10 min，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使其溶解，作为供试品溶液。另取茯苓对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取茯苓酸对照品1 g，加甲醇配制为0.1 mg/mL的茯苓酸对照品溶液。吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板，以V甲苯∶V乙酸乙酯∶V甲酸=20∶5∶0.5为展开剂，展开，取出晾干，喷以V香草醛硫酸溶液(2%)∶V乙醇=4∶1混合溶液，105 ℃加热至斑点品色清晰。

1.2.6 浸出物测定 水溶性浸出物含量参照《中国药典》2020版四部通则2201浸出物测定法测定[26]。取供试品约2 g，精密称定，置250 mL的锥形瓶中，精密加水50 mL，密塞，称定重量，静置1 h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，以干燥品计算供试品中水溶性浸出物的含量(%)。按照水溶性浸出物测定法测定，以稀乙醇代替水,进行醇溶性浸出物含量测定。

1.2.7 特征基因序列比对及进化分析 ①模板DNA制备：采用试剂盒提取法，选用通用型植物基因组DNA提取试剂盒，按说明书步骤分别提取3株茯苓菌株的总DNA，取2 μL用超微量分光光度计测试其浓度及纯度，剩余-20 ℃保存备用。 ②特征基因序列扩增体系及程序：参考Wu等[27]选取核糖rDNA内部转录间隔区(ITS)、核糖体大亚基(LSU)、翻译延伸因子(TEF1-α)引物序列，合成通用上下游引物(表1)，以提取的总DNA为模板扩增ITS、LSU、TEF1-α基因序列。扩增体系：DNA模板1 μL，金牌Mix 22 μL，正向引物1 μL(10 μmol/L)，反向引物1 μL(10 μmol/L)，总体积25 μL。反应程序参照Song 等[28]：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性10 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃最后延伸10 min，4 ℃结束。取2 μL PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像观察；取10 μL送至北京擎科新业生物技术有限公司测序。数据分析及系统进化树构建：在NCBI数据库将ITS、LSU、TEF1-α序列测序结果进行BLAST比对，获取与供试菌株相似性较高的菌株序列。应用MEGA6.0软件进行进化树分析[29]，将测序获得的3株茯苓菌株的ITS、LSU、TEF1-α以及ITS+LSU+TEF1-α分别进行多序列比对，去掉两端差异序列，运行1 000次Bootstrap，邻接法聚类分析构建系统发育树[30]。

表1 ITS、LSU、TEF1-α基因序列扩增引物

1.2.8 统计学分析 转化率和浸出物以平均值±标准差(SD)表示。通过使用SPSS statistics 26(美国纽约州纽约市国际商业机器公司)对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，通过LSD的多范围检验P<0.05确定显著性差异。

2 结果与分析

2.1 菌丝及菌核表观性状特征

太空10号菌株栽培所得菌核呈类球形、椭圆形、扁圆形或不规则的块状，大小不一，如图1A和图1B所示。外皮薄而粗糙，棕褐色至黑褐色，有明显隆起的皱纹。体重，质地坚硬，断面不平坦，呈颗粒状或粉状，有的具裂隙，外层淡棕色，内部白色(图1C)。气微，味淡，嚼之粘牙。菌丝细长，菌丝体外观均呈白色绒毛状，具有独特的多同心环状菌落(图1D)。显微镜下观察茯苓粉末水合氯醛装片，如图1E和图1F所示，可见不规则状团块和分枝状团块，菌丝无色，细长稍弯曲。

图1 太空10号菌核、菌丝及水合氯醛装片显微性状Fig.1 Microscopic characters of sclerotia, hypha and chloral hydrate of MBIS No.10 A、B：菌核；C：菌核断面；D：菌丝；E：水合氯醛装片显微下颗粒状团块；F：水合氯醛装片显微下颗粒状菌丝 A,B: Sclerotium; C: Sclerotia section; D:Mycelium; E: Chloral hydrate was loaded into tablets, and granular masses were observed under microscope; F:Chloral hydrate tablets were loaded and the granular hyphae were observed under microscope

生物冷冻电镜扫描下观察，茯苓太空10号菌核呈不规则柱状凸起的团块(图2A)。如图2B所示，不规则柱状凸起表面光滑，多短小分支，直径5～15 μm。同时，菌核内存有少量细长菌丝，表面或附有绒毛，或光滑，或细小隆起，菌丝粗细不一。粗壮的菌丝由细长菌丝拧绳状融合而成(图2C)。电镜下平板上菌丝体呈细长管状，未见锁状联合，表面有的光滑，有的具有小球状凸起，推测凸起部分为菌丝生长分泌物，或菌丝隆起膨大而成(图2D)。如图2E和图2F所示，部分菌丝具有明显的分节和菌丝体膨大特征。结合茯苓菌核表观性状和显微特征，推测茯苓菌核是由菌丝拧绳状融合，或由菌丝不规则膨大堆积而成。

2.2 不同菌株拮抗反应

拮抗试验是鉴定食药用菌间遗传差异的传统方法，菌丝间的拮抗反应是不同遗传特性的重要表现[31-32]。通过茯苓太空10号、湘靖28和5.78菌株两两之间平板实验分析其拮抗反应。如图3所示，太空10号和湘靖28的拮抗线相对不明显，拮抗反应较弱，说明两个菌株的亲缘关系较近，太空10号和5.78以及湘靖28和5.78拮抗线明显，拮抗反应较强，说明亲缘关系较太空10号和湘靖28之间的亲缘关系疏远。

图2 太空10号菌核、菌丝冷冻电镜扫描特征Fig.2 Scanning characteristics of sclerotia and hyphae of MBIS No.10 under freeze electron microscope A～C：菌核；D～F：平板上菌丝 A-C: Sclerotium; D-F: Mycelium on the plate

图3 茯苓太空10号、湘靖28和5.78菌株拮抗反应Fig.3 Antagonistic reaction of MBIS No.10, Xiangjing 28 and 5.78 strainsA：太空10号与湘靖28拮抗反应；B：太空10号与5.78拮抗反应；C：湘靖28与5.78拮抗反应；D：太空10号与湘靖28拮抗反应平板背面；E：太空10号与5.78拮抗反应平板背面；F：湘靖28与5.78拮抗反应平板背面A: Antagonistic reaction of MBIS No.10 and Xiangjing 28; B: Antagonistic reaction of MBIS No.10 and 5.78 strains; C:Antagonistic reaction of Xiangjing 28 and 5.78 strains; D: Back of MBIS No.10 and Xiangjing 28 antagonistic reaction plate; E: Back of MBIS No.10 and 5.78 strains antagonistic reaction plate; F:Back of Xiangjing 28 and 5.78 strains antagonistic reaction plate

2.3 不同温度下菌丝的生长速度测定

于10、20、30、40 ℃温度下培养茯苓太空10号、湘靖28和5.78 菌株，发现3个菌株在10、40 ℃下茯苓菌丝基本不生长，在20 ℃条件下能够生长，30 ℃条件下生长较快(图9)。3株茯苓菌株在20 ℃下培养的生长速度差别较大(图4A)，太空10号生长速度明显高于湘靖28和5.78，第2天时3株菌株生长速度之间有显著性差异，第5天时太空10号和5.78有显著性差异(P<0.05)；30 ℃条件下不同菌株质检生长速度差别不明显，第1天时太空10号和湘靖28有显著性差异(P<0.05)(图4B)。可见温度过低或过高都不利于茯苓菌丝生长，选取适宜的栽培温度是提高茯苓产量的一个重要因素。

2.4 大田栽培结苓和转化率研究

茯苓太空10号、湘靖28和5.78菌株均能正常结苓，太空10号的平均结苓个数为5个/窖，湘靖28和5.78菌株均为5个/窖(表2)。3个茯苓菌株的鲜质量产量也存在差异，其中太空10号的总鲜质量为5.53 kg/窖，而湘靖28和5.78菌株分别为3.07 kg/窖和4.00 kg/窖。3株茯苓菌株所得菌核药材的生物转化率也存在差异，太空10号菌株的鲜质量转化率和干质量转化率均为最高，其中太空10号鲜质量转化率比湘靖28高出44.41%，比5.78高出34.55%，干质量转化率比湘靖28高出42.42%，比5.78高出24.23%。

图4 茯苓太空10号、湘靖28和5.78菌株生长速度比较Fig.4 Comparison of growth rates of MBIS No.10, Xiangjing 28 and 5.78 strainsA：20 ℃，B: 30 ℃；* 表示差异显著(P<0.05)A: 20 ℃, B: 30 ℃; * The difference was significant (P<0.05)

表2 茯苓太空10号、湘靖28和5.78菌株结苓和菌核生物转化率

2.5 薄层色谱分析

茯苓太空10号、湘靖28和5.78菌株所得菌核药材与茯苓酸对照品、茯苓对照药材的薄层色谱如图5所示。结果显示在与茯苓酸和对照药材色谱相应的位置上，茯苓太空10号、湘靖28和5.78菌株大田栽培所获得的菌核药材均显相同颜色的主斑点，其中茯苓酸的比移值Rf为0.43，色谱主要斑点分离度良好，斑点清晰，符合《中国药典》2020版一部茯苓项下薄层色谱要求。

图5 茯苓太空10号、湘靖28和5.78菌株薄层结果 Fig.5 Thin layer results of MBIS No.10, Xiangjing 28 and 5.78 strainsA：茯苓酸；B：茯苓药材样品；C：太空10号；D：湘靖28；E：5.78A:Poria acid;B:Samples of P.cocos;C:Space 10; D:Xiangjing 28; E:5.78

2.6 浸出物测定

根据中国药典和欧洲药典的指标限量要求，对茯苓太空10号、湘靖28和5.78菌株大田所得菌核药材的醇溶性浸出物和水溶性浸出物含量进行了测定。由表3可见，太空10号水溶性浸出物含量为1.77%，低于湘靖28(水溶性浸出物含量为2.57%)和5.78(水溶性浸出物含量为2.45%)。而对于醇溶性浸出物含量，太空10号为3.00%，湘靖28为2.50%， 5.78为2.29%，太空10号具有较高的醇溶性浸出物含量。

表3 菌株茯苓太空10号、湘靖28和5.78浸出物含量

2.7 ITS、LSU、TEF1-α基因序列比对及进化分析

菌株茯苓太空10号、湘靖28和5.78的ITS、LSU、TEF1-α基因扩增片段琼脂糖凝胶电泳条带清晰(图6)，与Marker比较其长度分别为1 600、1 400、600 bp左右，测序后双向拼接得到完整的ITS、LSU序列和TEF1-α序列，其长度与电泳结果一致，将其进行序列比对，菌株太空10号与湘靖28和5.78的ITS、LSU、TEF1-α基因序列相似性达100%。将菌株太空10号ITS、LSU、TEF1-α基因测序结果分别在NCBI数据库进行在线BLAST，成功得出3个基因序列均与茯苓同源，选取评分较高序列及参考Wu 等[27]选取外源菌株TrametessuaveolensCui 11586序列比对，进行遗传关系分析，制作系统进化树(图7、8、9、10)。ITS、LSU、TEF1-α以及ITS+LSU+TEF1-α进化树结果中，太空10号、湘靖28、5.78 三株菌株均聚类为一支，表明3株菌株亲缘关系较近。

图6 茯苓太空10号、湘靖28和5.78菌株ITS、LSU、TEF1-α序列PCR产物电泳结果 Fig.6 MBIS No.10, Xiangjing 28 and 5.78 strains its, LSU and TEF1-α electrophoresis results of sequence PCR products M：2 000 bp DNA ladder Marker；1、2、3：ITS序列；4、5、6：LSU序列；7、8、9：TEF1-α序列；1、4、7：太空10号；2、5、8：湘靖28；3、6、9：5.78M: 2 000 bp DNA ladder Marker; 1, 2, 3: ITS sequence; 4, 5, 6: LSU sequence; 7, 8, 9: TEF1-α Sequence; 1, 4, 7: MBIS No 10; 2, 5, 8: Xiangjing 28; 3, 6, 9: 5.78 strains

图7 菌株茯苓太空10号、湘靖28和5.78 ITS基因遗传关系聚类分析Fig.7 Cluster analysis of ITS gene genetic relationship of MBIS No.10, Xiangjing 28 and 5.78 strains

图8 菌株茯苓太空10号、湘靖28和5.78 LSU基因遗传关系聚类分析Fig.8 Cluster analysis of genetic relationship of LSU gene of MBIS No.10, Xiangjing 28 and 5.78 strains

图9 菌株茯苓太空10号、湘靖28和5.78 TEF1-α基因遗传关系聚类分析Fig.9 Cluster analysis of TEF1-α gene genetic relationship of MBIS No.10, Xiangjing 28 and 5.78 strains

图10 菌株茯苓太空10号、湘靖28和5.78 ITS+LSU+TEF1-α基因联合遗传关系聚类分析Fig.10 MBIS No.10, Xiangjing 28 and 5.78 strains ITS+LSU+TEF1-α cluster analysis of genetic association

3 讨 论

太空具有诸多与地球完全不同的环境因素，除强烈的太空辐射外，还有微重力、高真空、弱磁场等。太空辐射是公认的有效的诱变因子，容易引起种子后代遗传性状的变化[34]。研究发现，香菇、平菇、黑木耳、金针菇、灵芝等食用菌经太空诱变产生了拮抗反应、生长速度等方面的变化[35]。通过将搭载“神舟十号”太空诱变选育的菌株茯苓太空10号与菌株湘靖28、5.78对比分析，对其进行生物特性分析和品质评价，为进一步开展茯苓种质资源创新、品种保护及优良品种选育提供新思路。

本研究根据《中国药典》2020年版规定，茯苓药材的性状、显微、薄层色谱、浸出物含量等各项指标是其品质评价的重要依据[1]，对其各项数据进行测定。结果表明，表观性状上，菌株太空10号符合《中国药典》2020版一部茯苓项下的性状描述。薄层色谱斑点清晰，达到《中国药典》2020版茯苓药材要求标准。生理指标上，在28～30 ℃茯苓最适生长温度下[36]，菌丝体生长速度差距不明显，20 ℃低温培养，茯苓太空10号菌株呈现出较快的生长速度，规模化生产中与其他两个菌株相比可节省工时，呈现出提高经济效益优势。大田栽培实验中，太空10号的菌核质量较优，与其他两个菌株相比，结苓个数、最大单个鲜质量、总鲜质量、鲜重转化率、干重转化率为其他两个菌株的1.2～1.8倍，呈现出增产优势。菌株太空10号醇溶性浸出物含量达3.0%高于药典标准，呈现出品质优良优势。结果表明，经过诱变的菌株太空10号茯苓菌核性状符合茯苓药材要求，且通过传统栽培法能达到生长情况良好，呈现出一定的提高经济效益、增产、品质优良等培育优势，具有推广应用潜力。

相关研究显示，ITS序列间差异应用于研究属内和属间物种关系时十分有价值，尤其可用于近似种的区分[37]，而LSU、TEF1-α序列因其可较好地反映菌株遗传关系特点，也常被用于进行系统发育研究[38-39]。2020年Wu 等[27]在茯苓中开展了相关研究，并将中国茯苓与北美茯苓区分为两个不同种，参考其选用的及已在其他食药用真菌中应用的ITS、LSU和TEF1-α进行扩增序列比对分析联合拮抗反应，在基源鉴定上，发现3株菌株之间没有显著遗传差异，呈现出稳定遗传优势，具有推广应用潜力。但太空环境对茯苓细胞具体哪些生理和成分关联的基因进行了突变有待进一步研究。