细菌在逆境条件下膜脂肪酸变化的研究进展

梅迩蓝, 包秋华

(内蒙古农业大学 食品科学与工程学院乳品生物技术与工程教育部重点实验室农业农村部奶制品加工重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018)

细菌不可避免地受到不利于其生长的逆境环境条件胁迫。在逆境条件下，细菌细胞膜最先受到环境的刺激。通过扫描电镜观察应激细胞的形态特征，显示细胞膜会产生一定程度的损伤[1-3]。细胞膜是包裹细胞质的一层柔软而富有弹性的半透性薄膜，由磷脂双分子层和蛋白质组成，是控制细菌细胞进行物质交换的屏障，具有膜组分的不对称分布和流动性等特点。磷脂双分子层提供了细胞膜的基础结构，其含有高度疏水的脂肪酸和相对亲水的甘油两部分，磷脂占膜脂质总量的70%以上。细菌可以通过调节脂肪酸的种类和组成，调节细胞膜的流动性，维持膜的稳定性及正常生理功能，以此来减少逆境对其造成的损伤[4-6]。有些微生物能在不良环境胁迫下进入活的不可培养(Viable but non-culturable，VBNC)状态[7]。本文将从细菌逆境胁迫及诱导因子、细菌和部分VBNC态细菌在逆境胁迫下的膜脂肪酸种类及含量的变化以及脂肪酸的检测方法等方面的研究进展做详细介绍。

1 细菌逆境胁迫及其诱导因子

细菌逆境胁迫通常指对细菌生长和生存的各种不利环境因素的总称，这些不利因素又称诱导因子，如温度、射线、盐度或渗透压、寡营养、干燥、pH的剧烈变化等[8-9]，这些环境诱导因子均可以引起细菌发生一系列生理生化变化，从而产生应激反应。

目前VBNC 态的研究是其中一个热点。VBNC态是指细菌在不良环境胁迫下，有些细菌仅保留很低的代谢活性但无法分裂，失去在培养基上形成菌落的能力，当给予合适条件时即可以恢复生长繁殖能力的状态[7]。细菌VBNC态作为微生物学的一个全新概念，受到极大地关注，它对传统的微生态学、食品安全、水质监测、菌种保藏及流行病学研究等均提出了新的挑战[7,9-12]。目前已报道有100多种微生物可进入VBNC态[9]，包括大肠埃希菌(Escherichiacoli)[9-10，12]、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)[9-10]以及一些致病菌如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)[9-10]和奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)[11]等。细菌的VBNC态细胞和活的可培养细胞之间存在生理和分子差异，主要表现在细胞壁和细胞膜组成、基因表达、黏附特性、毒力潜力、代谢、细胞形态以及物理和化学抗性。例如，大肠埃希菌在VBNC态诱导过程中细胞尺寸会减小，并且发生矮化并出现圆形细胞[12]。有些致病菌VBNC态在常规培养基检测不到，但条件适宜又会复苏，容易造成假阳性结果，对公共健康将造成严重威胁[9]。另外，食品工业中污染菌VBNC态会影响产品质量，比如植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)[13]和短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)[14]在低温和脱气的啤酒诱导下可进入VBNC态，引起假阴性检测，导致啤酒变质。使得细菌逆境条件的变化研究具有重要意义。

温度是对微生物生长最具影响的环境因素，在高于或低于最适生长温度时，微生物会产生一系列应激机制来抵抗这种温度变化。胁迫环境能够诱导多种胁迫相关基因的表达，提高菌体适应胁迫环境的能力[15]。低温微生物可以通过改变细胞膜脂肪酸组成及含量调节细胞膜的流动性和基本功能，比如提高膜脂中脂肪链双键的数目，在低温条件下多不饱和脂肪酸含量的增加会降低低温对细胞膜流动性的影响[16]。热胁迫会引起蛋白质的变性和聚集，菌体内产生一系列热休克蛋白来提升菌体的耐受能力，有研究发现干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei) Zhang在43 ℃恒温培养箱中连续传代60 d，随着热胁迫时间的增加，耐热性也呈现一定的增长趋势，此外连续热胁迫处理后的菌株生长性能较强，对热胁迫的耐受性也较强，可见热胁迫可使一些细菌产生热应激反应，对细菌抵御逆境机制具有重要影响[15]。

改变细菌培养的营养底物、富营养化培养或者饥饿胁迫均会使细菌产生逆境胁迫机制，甚至进入VBNC态[17]。有研究表明外源脂肪酸的添加有助于巴氏醋杆菌(Pasteurellamultocida)应对乙醇的胁迫，添加不饱和脂肪酸会增强细胞膜流动性及透性，而添加饱和脂肪酸却减弱细胞膜流动性及透性[18]。聚-β-羟丁酸酯(poly-β-hydroxybutyrate，PHB)是一种存在于许多细菌细胞质内属于类脂性质的碳源类贮藏物。Ralstoniaeutropha(富养罗尔斯通氏菌)H16的可培养性与温度、营养物积累有很大关系，不能富集PHB的R.eutrophaΔphaC(PHB synthase gene,聚羟基丁酸酯合成酶基因)缺陷型菌株在PBS中从30 ℃降到5 ℃，24 h内很快进入VBNC态；正常细菌富集PHB后阻止其进入VBNC态[19]。

细菌在实际应用中遇到的胁迫条件是复杂和交叉的，各种胁迫往往同时发生，相互影响。Salmonellasenftenberg(山夫顿堡沙门氏菌 )CECT 4384受酸和冷应激组合后会提高其对热(63 ℃)的耐受性[20]。发状念珠蓝细菌(Nostocflagelliforme)细胞具有一定的自我保护系统，在高温、盐碱、重金属以及两两交叉胁迫处理后，被发现可以抵御不良环境造成的轻度伤害[21]。干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei) ATCC 393酸胁迫预适应能够显著提高细胞对热处理及氧处理的交互胁迫抗性，可能是因为酸胁迫改善细胞内pH以及与细胞膜脂肪酸不饱和度相关[22]。

2 逆境胁迫下细菌膜脂肪酸的种类及含量的变化

细胞膜是由磷脂构成的富有弹性的半透性膜，是防止胞外物质自由进入细胞，将细胞与外界隔离的屏障，保证了细胞内环境的相对稳定。磷脂双分子层构成细胞膜基本骨架，蛋白质分子以不同的形式镶嵌、贯穿或覆盖在磷脂双分子层表面，其中载体蛋白和通道蛋白对控制物质进出细胞有选择性调节作用，受体蛋白能感受外界各种化学信息进行细胞间的信息交流，磷脂双分子层对细胞与外界环境相对隔离形成稳定环境起到重要作用，分为亲水端和疏水端，是一种由甘油、脂肪酸和磷脂所组成的分子。磷脂的亲水和疏水双重性质使其具有方向性，由双层磷脂构成的质膜其疏水的两层脂肪酸链相对排列在内，亲水的两层磷酸基则相背排列在外，类似G-细菌细胞壁外层的双层磷脂结构(外膜)，这种排列结构使细胞膜成为有效控制物质通透的屏障可以执行多种生物学功能[16,23]。细胞膜磷脂的脂肪酸组成及含量对细胞膜流动性起到关键作用，根据双键数目将脂肪酸分为饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸两类，饱和脂肪酸结构整齐，排列紧密有序，碳链间容易形成氢键，化学性质较为稳定，因而细胞膜流动性小；不饱和脂肪酸常温下呈液态，其中的不饱和键使脂质分子尾部形成弯曲，导致脂肪酸排列疏松而无序，从而不易集结在一起，因而对保持膜的相对流动性具有重要作用[23]。流动性镶嵌模型(图1)是迄今为止备受关注的生物膜结构模型。

图1 细胞膜的流动性镶嵌模型Fig.1 Mosaic model of cell membrane fluidity

脂肪酸合成(Fatty Acid Biosynthesis, FAS)是生命活动的基石, 是所有生命体不可或缺的基础代谢途径之一。细菌具有Ⅱ型脂肪酸合成系统(FAS-II)。FAS-II是细菌体内进行饱和/不饱和脂肪酸合成的唯一必需途径，它是由一系列单一基因编码的可溶性酶组成，通过依次循环式的识别和催化由酰基载体蛋白(ACP)价携带的脂肪酸碳链底物来实现特定长度饱和/不饱和脂肪酸碳链的延长和合成[24]。通常不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸(UFA/SFA)比率被用作膜流动性的间接指标，具有高UFA/SFA 比率的细胞膜显示出高流动性[20,25-27]。比如，干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei) Zhang适应性进化菌株(pH 4.3 MRS 培养基中连续传代70 d)在酸胁迫条件下，细胞膜脂肪酸种类及含量会发生变化，UFA/SFA 比率由1.32增加到1.74，同时还通过增加脂肪酸链长度等，来减少由逆境胁迫引起的对细胞造成的伤害，提升耐酸性[25]。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)CECT 443在不同生长温度下培养，发现在45 ℃培养时细胞的UFA/SFA比率为0.22，明显小于培养温度为10 ℃(0.65)和25 ℃(0.61)，可见UFA/SFA比率随着生长温度的降低而升高，这一结果是由于不饱和脂肪酸比例增加，主要是C18∶1的变化，而饱和脂肪酸的比例几乎保持不变，可见鼠伤寒沙门氏菌CECT 443对生长温度降低的主要反应是膜脂不饱和脂肪酸水平的显著增加[26]。这一结论在巴氏醋酸杆菌(Acetobacterpasteurianus)CICIM B7003进行乙酸耐受性试验也得到验证，发现乙酸诱导后饱和脂肪酸主要是棕榈酸和硬脂酸的含量逐渐降低，不饱和脂肪酸主要是油酸的比例不断升高，其含量由24 h的21.59%上升到发酵结束前的43.58%，推断不饱和脂肪酸的增加会导致细胞膜流动性增强，对逆境环境产生胁迫机制[27]。

不饱和脂肪酸根据双键数目有单不饱和、多不饱和之分。窦京娇[28]对3株北极海冰细菌进行耐低温及耐盐度试验，结果表明，低温环境使菌体质膜单不饱和脂肪酸含量升高，较为显著的是C16∶1和C18∶1，推断不饱和脂肪酸可能对维持细胞膜流动性起着关键作用；高盐环境下培养，C16∶1的相对含量显著升高，由9.42%增加到12.94%，由此推测，可能在高盐环境下C16∶1是维持细胞正常生长的一个关键因素。另外，对创伤弧菌在冷胁迫和寡营养的研究中也得出了类似的结论，创伤弧菌(Vibriovulnificus) 在人工海水中降温至5 ℃后会进入VBNC态，正常条件时,创伤弧菌的棕榈酸(C16∶0)、棕榈油酸(C16∶1)和硬脂酸(C18∶0)为主要的脂肪酸，5 ℃低温保持24 d后，棕榈油酸(C16∶1)增加，棕榈酸(C16∶0)的脂肪酸组分急剧下降了5%，其膜脂肪酸发生的变化对其存活起到关键作用[29]。

通过研究细菌逆境下细胞膜脂肪酸的变化，一个潜在重要应用价值被发现。由于不饱和脂肪酸有降血脂、预防心脑血管疾病等功能，目前获得不饱和脂肪酸的主要途径是从鱼油和植物种籽中提取，然而这种生产方式已经不能满足大量的市场需要。鉴于有些微生物在逆境条件下可通过增加膜中不饱和脂肪酸的组成和含量来调节膜的流动性，根据这一特点，可以利用这类微生物制备不饱和脂肪酸。在研究耐冷细菌的适冷机制中发现，耐冷细菌为了保持细胞膜的流动性，会在细胞膜上产生大量的脂质与不饱和脂肪酸，这一机制为利用耐冷细菌制备不饱和脂肪酸提供了理论依据，所以耐冷细菌可能作为长链不饱和脂肪酸的生产者则成为不饱和脂肪酸新的来源[30]。

有研究表明，不饱和脂肪酸增加并不是细菌单一的抗逆境机制，相反，在逆境环境中有些细菌的不饱和脂肪酸会减少，从而抵抗环境变化。对大肠埃希菌ATCC 43889分别经50、60和70 ℃各10次热胁迫处理并转接10次培养后，热胁迫菌株随着热胁迫温度的升高，细胞膜中饱和脂肪酸C13∶0、C16∶0、C17∶0及其饱和脂肪酸总含量由30.96%逐渐升高到58.90%，而不饱和脂肪酸C14∶1、C16∶1、C17∶1、C18∶1n9t和C18∶2n6t及不饱和脂肪酸总含量由69.04%降低到24.60%，菌体细胞膜流动性下降，生物膜生成能力增强，一些外膜蛋白表达量提高，表达种类增加，菌株耐热性增强，这些变化有利于其适应不利的热胁迫环境，提高生存能力[31]。不同菌株在逆境条件下脂肪酸的变化统计见表1。

表1 不同菌株在逆境条件下脂肪酸的变化统计

3 细菌膜脂肪酸的提取方法

研究细菌在逆境胁迫环境诱导下细胞膜脂肪酸种类及含量的变化时，脂肪酸提取方法对脂肪酸种类测定结果有很大的影响，故细菌细胞膜脂肪酸的提取方法受到广泛重视。这是由于脂肪酸是细菌细胞膜的重要组成物质之一，受细胞遗传物质的控制，具有灵敏度高的特点，在细菌中已发现300多种脂肪酸，每种细菌都有自己独特的碳链长度、双键位置和不同的功能团组合；又因为脂肪酸极性较强，且挥发性和稳定性较低，提取方法的适用范围不同，各有优缺点[32]。

脂肪酸组成的分析通常通过气相色谱法进行。传统上，气相色谱法脂肪酸样品的制备包括两个独立的步骤：提取和甲基化[33]。这是因为细菌细胞中的脂肪酸主要是以酯化形式存在，因此需要将脂肪酸游离出来，但是游离状态的脂肪酸沸点一般都很高，而气相色谱法检测只能分析低沸点的挥发性物质。故在分析前，需要将游离脂肪酸转变为更易挥发的脂肪酸甲脂[32]。脂肪酸能否成功地全部转化成游离状态与提取的皂化时间、添加的皂化试剂紧密相关，游离态的脂肪酸能否全部转化为易挥发性的物质与提取时间和所用的甲基化试剂有密切关系[32]。MIDI Sherlock细菌鉴定仪就是根据不同细菌特有的脂肪酸种类和含量的差异，通过气相色谱仪来鉴定细菌的。MIDI提取脂肪酸的方法是先用甲醇钠使其在碱性条件下水解，然后在酸性条件下酯化。MIDI脂肪酸提取方法有给定的试剂配方和步骤[32，34-35]。不同的细菌脂肪酸提取方案可以在此基础上进行优化。比如刘国红等[32]利用MIDI Sherlock细菌鉴定仪优化了提取芽胞杆菌脂肪酸的皂化、甲基化时间及试剂用量，探索出最佳的脂肪酸提取条件，结果表明40 mg菌体的皂化时间维持在25～30 min的脂肪酸鉴定效果较好，皂化试剂用量对脂肪酸提取效果无显著影响，甲基化试剂量为1.5 mL时检测结果较好。

脂肪酸提取前还可以采用超声等方法对细胞破碎，比如亓正良等[36]将细胞悬液用超声波破碎仪破壁20 min (240 W 55 kHz，1 s/3 s)，细胞破碎液8 000×g，离心10 min，取上清100 000×g超速离心1.5 h，沉淀即为细胞膜。

脂质通常通过使用有机溶剂如氯仿/甲醇等从细胞或组织匀浆中提取[33]。目前最常使用的方法是Bligh & Dyer法[37]，是由Bligh和Dyer于1959年首次提出从生物材料中提取和纯化脂肪酸的方法，简称BD法。将生物材料组织与氯仿-甲醇的混合物(V生物材料组织∶氯仿∶甲醇=1∶2)进行混匀震荡，加入氯仿及无菌去离子水，再加氯仿和超纯水，使得体系中V氯仿∶V甲醇∶V水=2∶2∶1，震荡20 min后离心，下层氯仿层包含萃取的所有脂质，取下层氯仿层加1 mol/L甲醇钠-甲醇进行甲酯化获得脂肪酸甲酯，即为纯化的脂质提取物[37-38]。

由于Bligh & Dyer法的甲酯化方法耗时耗力，可能导致样品丢失和污染，并产生有机废物，后续进行很多革新与改进，另一个通过三氟化硼-甲醇提脂肪酸方法被广泛应用。Kang 等[33]利用三氟化硼甲酯化制备脂肪酸甲酯，对分析各种生物样品中的长链脂肪酸组成有良好效果，Guerzoni 等[39]、李宝坤[40]均利用三氟化硼-甲醇作为甲酯化试剂提取生物材料脂肪酸都取得显著成效。

4 细菌脂肪酸的检测方法

细菌脂肪酸提取后，下步需要测定其脂肪酸种类及含量。现阶段有气相色谱、高效液相色谱、离子色谱、毛细管电泳、原子吸收分光光度等测定方法[41]。

气相色谱法(GC)是目前国内外应用最为广泛的一种脂肪酸检测方法，具有分离度好、灵敏度高等特点[32,35]。梅迩蓝等[38]利用气相色谱法检测干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)Zhang在模拟人工胃液下膜脂肪酸的变化，试验检测出7种饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸。高效液相色谱法(HPLC)一般来说对大分子、高沸点、热稳定性差、极性强的化合物分离具有显著优势，而且分析过程条件相对温和，高效液相色谱法具有“四高一广”(高压、高速、高效、高灵敏、应用范围广)的特点，可以被广泛应用于不同类型脂肪酸的检测。离子色谱法(ICE)较多用于分析细菌终末代谢酸的分析，其色谱分离条件也会大大影响分析结果的准确性，有研究对高效液相色谱法与离子色谱法进行对比研究，发现高效液相色谱法虽然线性检测范围宽, 但是检出限相对高，离子色谱法虽然检出限低，但是线性检测范围窄，如果进样的质量浓度过高会使得分离效果不佳，出现峰重叠的现象，还需对样品稀释后进样[42-43]。

气相色谱条件会影响物质的分离度，如色谱柱长度、色谱柱填料颗粒大小、柱温、载气长度、载气流速等均会对物质的分离效果产生影响。毛细柱一般有15、30、50、60、100 m等几种，一般15 m的柱子用来做10种物质以下的快速检测，柱长越长，样品中各物质分离的效果越好，若柱长过短可导致有些物质无法分离出来，有试验发现60 m的毛细管柱可分离出10种化合物[44]。100 m的色谱柱可分离25种脂质，当然这也与样品本身种类、脂肪酸种类有关[44]。梅迩蓝等[38]用60 m的柱子也可以区分37种脂肪酸甲酯标品。色谱柱填料颗粒越细，分辩效果越好，因为表面积增加，分离度就越高。柱温应考虑样品种类，当超过一定温度时，静态的液体通常会从色谱柱中挥发掉，所以选择柱温时应考虑到样品的沸点，Hawas 等[46]提取细菌菌株脂肪酸及其他脂类物质时检测器的温度设置为310 ℃，脂肪酸分离度较好，分析了饱和脂肪酸29种、不饱和脂肪酸23种。检测器通常包括电子捕获检测器(ECD)、氮磷检测器(NPD)、火焰离子化检测器(FID)和质谱检测器(MSD)，这些仪器的响应特性、灵敏度、检出限和线性范围都不同，需根据所测化合物性质进行选择，否则有些物质在不适合的检测器上的响应值很小或无响应。

表2 不同细菌膜脂肪酸的提取方法

色谱定量分析常见的方法有内标法、外标法和面积归一法。内标物的选择取决于待分析样品中预期富含的脂肪酸。如十七碳酸(C17∶0)可以用作内标，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。外标法是用已知浓度下定量的待测组分纯品作为对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量[47]。面积归一法是把所有出峰的组分含量之和按100%计算，某一种脂肪酸含量用组分所占百分比表示，应根据试验需求选择适当的色谱定量方法[38]。

以上这些方法各有优缺点，需要针对生物材料的特点选择合适的测定方法。

5 展 望

细菌为了抵御不利于生长的环境胁迫，通过接收和传递信号来响应这些变化，包括细胞膜脂肪酸组成与含量的改变、物质的传递、细胞生长和增殖、基因表达、代谢活性以及其他一系列变化，其中细胞膜脂肪酸组成与含量的改变是细菌在不利条件下保持生存能力的保障，在逆境应激反应中起着重要作用。由于自然界中99%以上的微生物因各种环境压力的驱使而处于不可培养态，至此国内外对VBNC态细菌的诱导、复苏、检测、机理等多方面研究还在不断深入中。鉴于细胞膜在细胞生命活动中有复杂功能的结构重要性，所以在今后的研究中，应不断优化细胞膜脂肪酸的提取及检测方法，提高检测的高效性和精准度，以便获得更准确的结果，为进一步解析细菌逆境胁迫机制提供参考。