黄粉虫蛋白替代豆粕影响尼罗罗非鱼肝肠健康的机制探究

时间：2024-08-31

张乐, 孙其, 李玮洁, 吴红霞, 乔芳, 杜震宇, 陈立侨, 张美玲

(华东师范大学生命科学学院, 上海 200241)

根据联合国粮农组织统计,2020年全球水产养殖总产量已经达到1.226亿吨,对全球水产动物产量的贡献率达到49.2%[1]。水产养殖的快速发展使水产饲料的需求量急剧上涨。据预测,到2025年,全球水产饲料总产量将从2015年的4 970万吨增加至8 710万吨[2]。然而,由于海洋渔业资源及耕地资源有限等原因,水产饲料中常用的蛋白源——鱼粉和豆粕供应紧张、价格激增,严重制约水产养殖业的健康快速发展。

昆虫作为某些鱼类的天然饮食成分,近年来在水产饲料中受到广泛关注[3-4]。昆虫的营养组成良好,其蛋白质水平通常在40%～63%,脱脂后的昆虫蛋白粉蛋白质含量可达83%[5]。某些双翅目昆虫的氨基酸组成与鱼粉类似,直翅目和鞘翅目昆虫体内的氨基酸结构则与大豆更为接近[6-7]。一般来说,大多数昆虫的氨基酸组成与水产动物生长需求呈现良好的相关性[7]。昆虫能够利用餐厨废料等低值副产物进行养殖,对生态系统的影响小,对土地和水资源的消耗也相对较少[8];与传统蛋白源鱼粉和豆粕相比,昆虫蛋白源具有更好的环境效益。许多养殖鱼类对昆虫粉具有良好的适应性。例如,非洲鲶(Clariasgariepinus)幼鱼能够适应饲料中添加172 g/kg的黑水虻虫粉,鱼体生长、营养利用和健康状况未受负面影响[9];在大西洋鲑(Salmosalar)饲料中使用黑水虻虫粉完全替代鱼粉,未见其对鱼体生长、营养组成和肌肉感官特性的负面影响[10];红海鲷(Pargusmajor)在饲喂了使用脱脂黄粉虫粉完全替代鱼粉的饲料后,鱼体生长性能和抗细菌感染能力得到显著提升[11];饲料中使用蝇蛆粉替代60%以下的鱼粉,未见其对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)饲料吸收和增重率产生不良影响[12]。

黄粉虫(Tenebriomolitor)为拟步甲科昆虫,是目前常用的昆虫蛋白源之一[13]。Rema等[13]报道,黄粉虫蛋白完全替代饲料中的鱼粉可以促进虹鳟(Oncorhynchusmykiss)幼鱼的生长,提高蛋白质效率。日粮中添加24%和36%的黄粉虫蛋白的饲料能够通过激活TLR/MyD88/IKK/NFκB信号通路,增强抗凋亡基因的表达,保护大口黑鲈(Micropterussalmoides)免受病原菌引起的肠道细胞凋亡和损伤[14]。在海鳟(Salmotruttam.trutta, L.)幼鱼饲料中,用40%的黄粉虫粉替代鱼粉,对鱼体的生长性能、存活率和饲料利用没有不利影响[15]。对大多数养殖鱼类来说,饲料中添加9%～38%的黄粉虫粉不会影响其生长性能[16]。但是当添加水平进一步增加,会对养殖鱼体产生一些负面影响,如抑制生长、影响消化[17-18]、降低抗氧化酶活力[19-20]、引起肝损伤[21-22]和肠道屏障受损[15]。对昆虫粉高比例替代鱼粉引起负面影响的原因,目前已有一些推测,包括:(1)昆虫粉中几丁质的存在[19];(2)饲料n-3脂肪酸和n-6脂肪酸比例的不平衡[23];(3)饲料中某些微量营养素的缺乏,如牛磺酸和某些必需氨基酸[4,24];(4)昆虫粉中存在内源性的蛋白酶和酚氧化酶[25-26]。但是,这些信息都源于替代鱼粉的研究,关于黄粉虫蛋白替代豆粕对鱼体的影响目前研究较少。

尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)是世界第三大养殖鱼类,2020年全世界总产量已达440.72万吨[1]。豆粕是尼罗罗非鱼商业饲料中主要的蛋白源[27]。研究发现,黄粉虫蛋白能够替代尼罗罗非鱼饲料中30%的豆粕而不影响其生长和肌肉品质[28],但是关于黄粉虫蛋白替代豆粕对尼罗罗非鱼肝脏和肠道健康的影响及其潜在的机制尚不明晰。因此,研究旨在阐明使用黄粉虫蛋白替代豆粕对尼罗罗非鱼肝脏和肠道健康的影响和可能的原因。

1 材料与方法

1.1 饲料和养殖管理

使用黄粉虫蛋白粉(购自广州泽合成生物技术有限公司,粗蛋白含量65.88%,粗脂肪含量4.19%,湿重基础)按照0、15%、30%和45%的比例替代尼罗罗非鱼饲料中的豆粕(购自山东渤海实业有限公司,粗蛋白含量46.05%,粗脂肪含量1.03%,湿重基础),加工制成4种等氮等脂(蛋白含量32%,脂肪含量6%)的实验饲料(饲料配方详见表1,其中酪蛋白、豆油、羧甲基纤维素钠、纤维素、抗氧化剂、磷酸二氢钙、氯化胆碱和诱食剂购自湛江市欧迅饲料有限公司,面粉购自五得利面粉集团有限公司,1%预混料购自青岛玛斯特生物技术有限公司),分别命名为YM0、YM15、YM30和YM45。实验所用的尼罗罗非鱼购自广州市添发鱼苗发展有限公司。暂养期间,使用商业饲料(粗蛋白水平33%,粗脂肪水平5%)进行喂养。暂养至平均体重达到70 g后,随机挑选初始重量为(70±0.12) g的尼罗罗非鱼360条,分为4组,每组设置3个养殖缸(500 L),在室内循环水养殖系统中进行养殖。日投喂量为体重的4%,于上午8:00和下午17:00进行投喂。养殖水温控制在26 ℃～28 ℃,pH值控制在7.5～7.9,溶解氧保持在6.5 mg/L以上,氨氮水平保持在0.02 mg/L以下,光周期为12 h光照/ 12 h黑暗。每两周记录一次每缸罗非鱼的平均体重,并调整相应的投喂量。养殖试验持续10周。

表1 饲料配方及营养水平组成Table 1 Experimental feed formulation and nutrient composition

1.2 样品采集

采样前,将尼罗罗非鱼禁食12 h。每组随机选择6条鱼,使用MS-222进行麻醉,随后进行尾静脉采血,将采集的血液样品在4 ℃冰箱中静置过夜后,3 500 r/min离心10 min获得血清,保存于-80 ℃以备后续分析。取血后,在冰上解剖分离获得肝脏和肠道样品,置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 生化分析

使用南京建成生物技术有限公司商业试剂盒,按照说明书对血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶活力、肝脏和肠道的超氧化物歧化酶活力、丙二醛含量和总抗氧化能力以及肝脏的甘油三酯、游离脂肪酸、糖原含量和谷胱甘肽氧化酶活力进行检测。肝脏的糖原合成酶活力以及肝脏和肠道的活性氧含量使用上海恒远生物技术有限公司的酶联免疫吸附法试剂盒进行检测。肝脏总脂含量检测使用氯仿-甲醇法。

1.4 组织学分析

每个处理组随机选取3条鱼的肝脏和肠道用于组织学分析。样品采集后,将组织立即置于4%的多聚甲醛溶液中固定24 h,随后置于脱水机中依次进行梯度脱水,进行石蜡包埋和OCT包埋。将包埋好的组织样品切成厚度为5 μm的薄片。对肝脏组织切片分别进行苏木精-伊红(H&E)染色、油红O染色以及过碘酸-雪夫(PAS)染色。对肠道组织切片进行苏木精-伊红(H&E)染色。在光学显微镜(尼康,日本)下观察和拍照。肠道肌层厚度、肠绒毛高度和宽度使用图像软件Nis-Elements F package version 4.60进行测量,每个处理组的肠道切片选取30个位点。

1.5 肠道通透性分析

每个处理组随机选择6条尼罗罗非鱼用于分析肠道通透性。用尤斯室灌流系统(金工鸿泰,中国)测定肠道跨上皮电阻(TER)来反映肠道通透性。具体操作步骤参照文献[29]。

1.6 转录组测序分析

使用RNA提取试剂盒(Promega,美国)提取YM0和YM45组尼罗罗非鱼肝脏和肠道组织的总RNA,随后使用带有Oligo (dT)的磁珠从总RNA中分离mRNA。向分离得到的mRNA中加入fragmentation buffer将其随机打断,再以片段化的mRNA为模板,反转录合成cDNA。随后对产物进行纯化和片段分选,利用分选产物进行PCR扩增,纯化后即得到转录组文库。转录组文库构建完成后,使用QuantiFluor dsDNA System进行初步定量,随后利用Illumina Hiseq X Ten平台对文库进行双端测序。转录组测序原始数据(raw data)已上传至NCBI,提交号分别为PRJNA852881(肝脏样本)和PRJNA910236(肠道样本)。

利用软件fastp对测序获得的数据进行质控。随后使用软件HiStat2与参考基因组比对,以获得用于后续分析的mapped data。利用DEGSeq2软件包分析YM0和YM45组的肝脏、肠道之间的显著差异表达基因(DEGs)。满足P-adjust<0.05并且|log2(fold change)|>2的基因被认定为DEGs。利用KEGG数据库进行差异基因KEGG富集分析,当P-adjust<0.05时,认为该通路在DEGs中显著富集。转录组的数据分析在美吉生物云平台(www.majorbio.com)上进行。

1.7 实时荧光定量PCR

肝脏和肠道组织样本的RNA提取和cDNA合成参照文献[29]。使用ef1α和β-actin作为管家基因。定量引物在NCBI上设计,引物序列详细信息见表2。使用CFX96 TouchTM实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad,美国)进行荧光定量检测。利用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。

表2 实验所用实时荧光定量PCR引物序列Table 2 Primer sequences used for quantitative real-time PCR in the experiment

1.8 数据分析

所有结果均使用平均值±标准误表示。使用SPSS Statistics 20.0软件(IBM,美国)对数据进行显著性分析。使用Shapiro-Wilk检验数据是否符合正态分布。使用单因素方差分析(ANOVA)检验各组间差异的显著性(P<0.05)。使用GraphPad Prism 7.00进行制图。

2 结果与分析

2.1 黄粉虫蛋白替代豆粕对尼罗罗非鱼肝脏健康的影响

本实验室先前的研究已经发现黄粉虫蛋白替代豆粕(0、15%、30% 和45%)并未对尼罗罗非鱼的生长性能产生显著影响,全鱼水分、粗蛋白和灰分含量在组间没有显著差异,粗脂肪含量在YM45组显著增加[28]。在肝脏健康方面,血清谷草转氨酶活力在4组之间没有显著差异[P>0.05,图1(a)]。血清谷丙转氨酶的活力随着黄粉虫蛋白替代豆粕比例增加而逐渐升高,当替代比例达到45%时,与对照YM0组相比呈现显著差异[P<0.05,图1(b)]。肝脏切片H&E染色结果显示,YM45组尼罗罗非鱼肝细胞边界模糊并伴有较为明显的脂肪变性[图1(c)]。油红染色结果显示,随着替代比例的增加,肝脏脂质沉积逐渐加剧[图1(d)和(e)]。进一步分析发现,YM45组罗非鱼肝脏的总脂、甘油三酯以及游离脂肪酸含量显著高于其他3组[P<0.05, 图1(f)～(h)]。肝脏切片PAS染色以及生化分析结果显示,随着替代比例的增加,肝脏糖原逐渐积累,在YM45组含量最高[P<0.05, 图1(i)～(k)]。肝脏糖原合成酶活力同样呈现随替代比例增加而逐渐升高,并且在YM45组具有最高值[P<0.05, 图1(l)]。结果表明,YM45组的尼罗罗非鱼肝脏脂肪和糖原沉积加剧,表现出肝损伤特征。

(a)血清谷草转氨酶活力(n=6);(b)血清谷丙转氨酶活力(n=6);(c)肝脏切片H&E染色(400×, n=3);(d)肝脏切片油红染色(200×, n=3);(e)肝脏总脂含量(n=6);(f)肝脏甘油三酯含量(n=6);(g)肝脏游离脂肪酸含量(n=6);(h)肝脏切片PAS染色(400×,n=3);(i)肝脏糖原含量(n=6);(j)肝脏糖原合成酶活力(n=6)。柱状图上带有不同字母表示存在显著差异(P<0.05)。图1 饲喂实验饲料10周的尼罗罗非鱼肝脏健康状况Figure 1 Liver health of Nile tilapia fed with the experimental diets for ten weeks

2.2 黄粉虫蛋白替代豆粕对尼罗罗非鱼肠道健康的影响

肠道组织学分析结果显示,随着黄粉虫蛋白替代豆粕比例的增加,肠道肌层厚度和绒毛高度逐渐下降,肠道绒毛宽度逐渐增加,YM30和YM45组与对照组相比存在显著差异[P<0.05, 图2(a)～(d)]。对肠道跨上皮电阻值进行分析检测,结果发现,YM30和YM45组的肠道跨上皮电阻显著低于YM0组[P<0.05, 图2(e)和(f)],说明肠道通透性在YM30和YM45组显著增加。肠道屏障相关基因claudin-1和cadherin-1在YM30和YM45组的表达量显著增加,occludin基因在YM45组的表达显著上调[P<0.05, 图 2(g)]。结果表明,黄粉虫蛋白替代豆粕使得YM30和YM45组尼罗罗非鱼的肠道屏障受损。

(a) 肠道切片H&E染色 (100 ×, n=3);(b) 肌层厚度(n=30);(c) 绒毛高度 (n=30);(d) 绒毛宽度 (n=30);(e)尤斯室灌流实验实时跨上皮电阻值 (n=6);(f) 肠道跨上皮电阻(TER)平均值(n=6);(g) 肠道屏障相关基因表达情况(n=6)。柱状图上带有不同字母表示存在显著差异 (P<0.05)。图2 饲喂实验饲料10周的尼罗罗非鱼肠道健康状况Figure 2 Intestinal health of Nile tilapia fed with the experimental diets for ten weeks

表3 饲喂实验饲料10周的尼罗罗非鱼肝脏和肠道氧化应激相关指标Table 3 Oxidative stress parameters in the liver and intestine of Nile tilapia fed with the experimental diets for ten weeks

2.3 黄粉虫蛋白替代豆粕对尼罗罗非鱼肝脏和肠道氧化应激相关指标的影响

饲料中添加昆虫粉可能会影响鱼体的氧化还原稳态,导致鱼体发生氧化应激[30],引起鱼体损伤,因此本实验在尼罗罗非鱼肝脏和肠道中对氧化应激相关指标进行检测。结果显示,肝脏活性氧含量在黄粉虫蛋白替代组(YM15、YM30和YM45)显著高于YM0组(P<0.05),在YM45组具有最高值。与YM0组相比,肝脏超氧化物歧化酶活力在黄粉虫蛋白替代组显著下降(P<0.05)。肝脏的谷胱甘肽氧化酶活力和总抗氧化能力随着替代水平的增加逐渐下降,在YM45组呈现显著差异(P<0.05)。肝脏丙二醛含量在YM45组显著高于其他3组。这些结果说明黄粉虫蛋白替代豆粕比例过高会引起肝脏氧化应激。

与YM0组相比,肠道活性氧含量在YM15组显著下降(P<0.05),在YM0、YM30和YM45组之间没有显著差异(P>0.05)。肠道超氧化物歧化酶活力在黄粉虫蛋白替代组显著高于YM0组(P<0.05)。肠道总抗氧化能力在黄粉虫蛋白替代组显著升高(P<0.05),在YM30组具有最高值。同时,肠道丙二醛含量在黄粉虫蛋白替代组显著高于对照组YM0(P<0.05)。这些结果说明,黄粉虫蛋白替代豆粕引起了肠道氧化应激指标的波动。

2.4 黄粉虫蛋白替代豆粕对肝脏和肠道转录组的影响

为探究潜在机制,对表型差异最为明显的YM0和YM45组的肝脏和肠道进行转录组测序分析。与YM0组肝脏相比,YM45组肝脏具有332个显著差异表达基因(DEGs),包含108个显著下调的差异基因和224个显著上调的差异基因[P-adjust<0.05,图3(a)和(b)]。对差异基因进行KEGG通路富集分析,富集到的前5位信号途径包括胰岛素抵抗信号途径、IL-17信号途径、胰岛素信号途径、凋亡-多物种信号途径以及AMPK信号途径。其中,胰岛素抵抗信号途径、胰岛素信号途径和AMPK信号途径均与代谢密切相关。这3条信号途径中共同的差异基因ppp1r3b、gys1和ppp1cc与糖原合成密切相关,并且在肝脏中糖原合成相关基因的表达水平随着替代比例的增加逐渐显著上调[P<0.05,图3(d)],这与肝脏切片PAS染色、糖原含量以及糖原合成酶活力的结果是一致的。在YM45组肝脏中同样富集到凋亡相关信号途径,对凋亡相关基因的相对表达进行检测,结果显示caspase8、caspase9和caspase3的表达水平在YM45组显著高于YM0[P<0.05,图3(e)]。YM45组肠道与YM0组肠道相比,共有128个显著差异表达基因,包含49个显著下调的差异基因和79个显著上调的差异基因[P-adjust<0.05, 图3(f)和(g)]。肠道差异基因的KEGG富集结果显示的前3位信号途径分别是果糖和甘露糖代谢、剪接体和固醇生物合成[P-value<0.05,图3(h)]。

(a)YM0和YM45组肝脏差异表达基因热图(n=3); (b)YM0和YM45组肝脏差异表达基因火山图(n=3);(c)YM0和YM45组肝脏差异表达基因KEGG富集分析弦图(排名前5位的信号途径,P<0.05,n=3);(d)肝脏糖原合成相关基因的表达(n=6);(e)肝脏凋亡相关基因的表达(n=6);(f)YM0和YM45组肠道差异表达基因热图(n=3);(g)YM0和YM45组肠道差异表达基因火山图(n=3);(h)肠道差异表达基因KEGG富集分析气泡图(排名前5位的信号途径,P<0.05,n=3)。柱状图上带有不同字母表示存在显著差异 (P<0.05)。图3 饲喂实验饲料10周的尼罗罗非鱼肝脏和肠道转录组分析结果Figure 3 Liver and intestinal transcriptome analysis of Nile tilapia fed with the experimental diets for ten weeks

2.5 肝脏和肠道转录组比较分析

为探究黄粉虫蛋白高比例替代豆粕造成尼罗罗非鱼肝脏和肠道损伤的共同机制,对YM0和YM45组肝脏和肠道转录组的共同差异基因进行比较,发现YM0和YM45组肝脏和肠道共同的差异基因有19个[图4(a)和(b)]。将肝脏和肠道中这19个共同差异基因用火山图分别进行展示,其中,与氧化应激紧密相关的klf9(Kruppfel-like factor 9)在肝脏和肠道中均具有相对较高的差异倍数和显著性[图4(c)和(d)]。随后,进一步对4个处理组的尼罗罗非鱼肝脏和肠道组织中klf9基因相对表达水平进行分析,结果显示,klf9基因在YM45组肝脏和肠道中均显著上调[P<0.05,图4(e)]。有报道,nrf2能够通过诱导klf9基因的表达进一步放大氧化应激[31]。通过对肝脏和肠道中nrf2基因的表达进行相对定量分析,结果表明,nrf2基因的相对表达量随替代水平的增加而逐渐上调,与YM0组相比,在YM30和YM45组的肝脏以及YM45组的肠道均呈现显著上调[P<0.05,图4(f)]。研究报道,klf9过表达会通过上调cd36的表达引起小鼠肝脏发生脂沉积[32]。研究对尼罗罗非鱼肝脏和肠道中cd36的相对表达量进行分析,发现与对照组相比,YM45组尼罗罗非鱼肝脏和肠道中cd36基因的表达均显著上调[P<0.05,图4(g)]。

3 讨论

实验使用黄粉虫蛋白替代尼罗罗非鱼饲料中不同比例的豆粕,探究其对鱼体肝脏和肠道健康的影响。结果显示,黄粉虫蛋白能够替代饲料中15%的豆粕而不影响鱼体肝脏和肠道健康。当替代比例增加至30%,鱼肠道屏障受损。当替代比例增加至45%,鱼体发生肝损伤,而肠道损伤也进一步加剧,主要表现为肝脏脂质和糖原积累、血清谷丙转氨酶活力增加以及肠道通透性升高。

肝脏在营养物质代谢、能量储存中发挥着重要作用[33]。肝脏脂质过量蓄积会影响水产动物的肝脏功能,使鱼体抵抗外界应激的能力下降[34]。组织学切片和生化分析结果均表明,随着黄粉虫蛋白替代豆粕比例的升高,尼罗罗非鱼肝脏脂质蓄积情况逐渐加剧,说明脂质蓄积可能是鱼体肝损伤的原因之一。肝糖原含量同样能够反映肝脏功能[35],糖原过量积累也会导致肝脏发生损伤[36-37]。本研究中PAS染色和生化分析结果均表明在45%替代组肝脏糖原显著积累。Vargas-Abúndez 等[38]发现,在小丑鱼饲料中添加黑水虻替代鱼粉的比例过高(≥50%)也会引起肝脏糖原含量显著升高,与本研究的结果一致。

肠道健康可以通过肠道组织结构及肠道通透性进行评估[29,39-40]。在本实验中,当黄粉虫蛋白替代豆粕比例达到30%和45%时,尼罗罗非鱼肠道的肌层厚度和绒毛高度显著下降,说明肠道功能受到一定损伤。通过尤斯室灌流系统检测肠道跨上皮电阻能够清晰直观地反映肠道屏障的健康状况,当肠道屏障受损时,肠道通透性增加,肠道跨上皮电阻下降[41]。本研究中,YM30和YM45 组尼罗罗非鱼肠道跨上皮电阻显著下降,说明肠道屏障受到损伤。与肝脏相比,肠道抗氧化相关指标的变化相对不明显。这说明与肝脏相比,肠道的抗氧化能力对黄粉虫蛋白替代水平的耐受性相对较高。

必需氨基酸的缺乏、昆虫粉中某些固有成分以及养殖动物氧化还原稳态失衡被认为与昆虫粉作为替代蛋白源引起的负面影响有关[4,19,23,29]。通过对饲料氨基酸组成进行分析,我们发现饲料中的必需氨基酸均满足尼罗罗非鱼的需要量,因此必需氨基酸的缺乏可能不是黄粉虫高比例替代豆粕引起肝肠损伤的主要原因[28]。有研究报道,果糖是黄粉虫中最丰富的游离糖,干重含量可达77.36 mg/100 g[42],并且在高等动物中研究表明果糖能够引起肝脏糖原积累[43]、肝脂变性[44]、代谢疾病[45]以及肠道屏障损伤[46]。通过对饲料中的果糖含量进行检测,发现果糖水平并未随着黄粉虫蛋白替代豆粕水平的增加而逐渐升高(表1)。饲料中n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)含量减少引起的n-3/n-6下降也是引起肝脂沉积的原因之一[23]。在本实验中,饲料n-3 PUFA含量分别为7.93%、8.82%、8.85%和8.48%,n-3/n-6分别为0.22、0.25、0.26和0.25[28],n-3PUFA 含量并未下降,n-3/n-6在3个黄粉虫蛋白替代组也均显著高于对照,说明饲料脂肪酸组成也不是引起肝损伤的原因。氧化应激是昆虫粉添加引起鱼体损伤的一个重要原因[30]。昆虫粉的营养组成丰富,极易在储存时因化学或微生物变化,发生腐败变质[47]。曹俊明等[12]推测脂肪氧化是蝇蛆粉高比例替代鱼粉引起凡纳滨对虾肝胰腺MDA含量增加的主要原因。我们之前的研究也发现黄粉虫蛋白高比例替代豆粕会使得饲料更易发生酸败变质,饲料酸价显著升高,引起罗非鱼肌肉发生氧化应激[28]。酸价主要评估饲料脂肪中游离脂肪酸的含量[48],饲料酸败会导致脂毒性的发生,引起肝肠发生损伤[49-50]。实验中观察到肝脏的游离脂肪酸含量随替代比例增加而逐渐上升[图1(h)],在YM45组的肝脏和肠道中同样观察到氧化还原稳态失衡,我们推测饲料酸败引起的氧化应激可能是黄粉虫蛋白高比例替代豆粕引起尼罗罗非鱼肝肠损伤的主要原因之一。

据报道,在氧化应激过度发生时,nrf2会上调klf9的表达,引发klf9依赖性的ROS积累,引发细胞凋亡[31]。过表达klf9能够通过上调cd36的表达引发小鼠肝脂沉积[32]。与klf9表达上调相一致,cd36在YM45组的肝脏和肠道中表达也显著上调,说明YM45组的肝脂沉积与氧化应激诱导的klf9表达增加有关。此外,nrf2的激活能够引起肝脏糖原积累、引发肠道损伤[36,51-52]。在YM45组的肝脏和肠道中,nrf2的表达均显著上调。因此,推测当使用较高水平的黄粉虫蛋白替代豆粕时,氧化应激的发生增加了肝脏糖原积累和肠道通透性。