亮氨酸94在光驱质子泵古紫质-4中的功能

刘冬雪, 赵 欣

(华东师范大学物理与电子科学学院上海市磁共振重点实验室, 上海 200241)

微生物视紫红质是一类由一分子视蛋白(opsin)和一分子配体视黄醛(retinal, Ret)共同组成的7次跨膜α-螺旋光敏受体蛋白,分布广泛,功能多样[1-3]。其中,古紫质-4(archearhodopsin-4,aR4)是存在于嗜盐菌HalobacteriumspeciesXZ515中的光敏受体蛋白,与模式蛋白细菌视紫红质(bacteriorhodopsin, bR)类似,均是光驱质子泵,并呈三聚结构[4-7]。bR中配体视黄醛与视蛋白螺旋G上的K216共价结合形成希夫碱(schiff base, SB),在暗适应态时以all-trans和13-cis两种构型混合存在,光适应态时基本转化为all-trans。bR受光激发后视黄醛由all-trans异构为13-cis,之后经历一系列光中间态(I-J-K-L-M-N-O)并将一个质子从胞内传递到胞外侧[8-11]。aR4和bR之间主要有两个差异,一是aR4除含有视黄醛外含有第二发色团菌红素(bacterioruberin),菌红素镶嵌在每两个单体形成的缝隙内,通过疏水作用力与视蛋白相结合,维持蛋白的三聚结构和功能[12-14];二是中性条件下质子传输时序相反,aR4是先从胞内侧吸收质子,再向胞外侧释放质子,而bR是先释放再吸收[5,15-16]。

视紫红质蛋白中发色团视黄醛的吸收特性会受到其与视蛋白的相互作用影响,关键残基的突变会导致吸收特征发生改变[17-20]。在bR中亮氨酸93 (Leu93, L93)位于螺旋C的胞质侧,是视黄醛键合区的关键残基之一[21]。L93与视黄醛的C13甲基距离约0.36 nm,研究表明L93通过空间位阻效应调控视黄醛构型,将L93突变为A后视黄醛最大吸收波长蓝移至540 nm左右,暗适应态下13-cis与all-trans视黄醛比例由1∶1变为1∶4[22-23]。L93与视黄醛间的相互作用还会造成光循环中间态动力学的改变。L93突变为A后希夫碱区域空腔变大,附近残基W182及螺旋C上的键合区残基T89、W86、W85侧链发生位移,松散的键合区空腔不利于视黄醛快速发生再异构化,因此,在光循环末期O态中仍存在未转变为all-trans的13-cis视黄醛,最终使N态和O态延长[22-27]。此外,L93A突变获取的O态晶体结构显示,螺旋C和螺旋G胞外侧部分和质子释放簇(proton release cluster, PRC)的结构与野生型bR的M态相似,而M态是质子释放的关键中间态,意味着L93可能通过空间位阻调控螺旋结构变化参与质子的释放[27]。

在aR4中L94是L93的等位保守残基,其对视黄醛异构化和质子传输的调制作用可能与L93有一定的相似性,然而L94与L93的作用差异性仍不清楚,且菌红素的存在将对其造成怎样的影响值得进一步研究。本文利用基因定点突变技术构建bR体系、双发色团BI-aR4(BI: bacterioruberin-included)体系和缺失菌红素的BE-aR4(BE: bacterioruberin-excluded)体系的L93/L94突变蛋白,采用紫外-可见光吸收光谱、闪光光解光谱、pH滴定等手段,研究L94在aR4中的作用及其与菌红素的关系。这一工作不仅揭示了L94在aR4中对视黄醛和质子泵的作用,也为双发色团光驱质子泵蛋白中关键残基的正确研究提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒pUC19(实验室);表达载体pNor-mini和表达宿主HalobacteriumsalinarumL33(复旦大学丁建东教授惠赠);表达载体pMPK66和表达宿主HalobacteriumsalinarumMPK409(中国石油大学黄方教授惠赠);DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性核酸内切酶MIUⅠ、BamHⅠ和HindⅢ、DNA Marker、Protein Ruler(TaKaRa);限制性核酸内切酶PspOMⅠ(益启生物科技有限公司);新生霉素粉末、氨苄青霉素粉末(Sigma);洛伐他汀粉末、盐酸四环素溶液、质粒提取试剂盒(生工生物工程有限公司);DNA胶回收试剂盒(AxyGen);pyranine染料(百灵威生物科技有限公司);其他常用化学试剂(国药集团化学试剂有限公司);引物合成及重组质粒的基因测序(上海铂尚生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 突变体引物设计及蛋白表达菌株构建

利用表达体系H.sp.L33和表达体系H.sp. MPK409成功构建重组野生型蛋白菌株,根据已建立的方法构建相应突变体菌株[14,28]。表1为蛋白的表达体系信息汇总,用表2中的引物分别扩增出全长基因,与载体连接后进行基因测序。3种体系中bR和BE-aR4体系基因测序正确后需进一步与pNor载体连接,重组质粒经双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳检测。之后将正确质粒转化到H.sp. L33和H.sp. MPK409中,分别用含新生霉素抗性和含洛伐他汀抗性的PM液体培养基进行筛菌,菌株用蛋白胨培养基进行培养。具体过程以L93A-bR为例:pUC19-bop为模板,分别用引物P1/P5、引物P2/P6扩增得到突变片段, 通过重叠延伸PCR获得全长基因。利用相对应的限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ及T4 DNA连接酶将其连接到pUC19载体上,pUC19质粒经TOP10感受态细胞扩增后测序。将测序正确的突变体片段连接到表达载体pNor上,成功连接后利用PEG600转化到L33菌株中,利用Nov抗性进行筛选,判断是否有目的蛋白。

1.2.2 蛋白表达和分子质量检测

用嗜盐杆菌高盐的蛋白胨培养基对菌株进行大规模培养,收获后除去细胞碎片及其他杂质,之后按照文献[14]中的蔗糖密度梯度法纯化目的蛋白,再用SDS-PAGE法检测蛋白的分子质量。

1.2.3 紫外-可见光吸收光谱

室温下,蛋白用溶剂(100 mmol/L NaCl,20 mmol/L KCl,pH 7)重悬,调节浓度后进行吸收光谱采集(普析通用T6新世纪)。暗适应态是蛋白储存在黑暗下48 h以上进行光谱扫描,光适应态是蛋白在卤钨灯下光照10 min后进行光谱扫描。

1.2.4 光循环中间态动力学及质子泵测定

室温下用上述溶剂调节蛋白浓度,利用自制闪光光解动力学装置测定光中间态动力学和质子泵。重组野生型蛋白、bR体系突变蛋白、aR4体系突变蛋白分别在410、410、380 nm处测定M态,在570、540、510 nm处测定基态,在640、570、600 nm处测定O态。中性条件下质子泵是测定pH敏感染料pyranine在456 nm处的瞬时吸收变化。

1.2.5 希夫碱、质子受体、质子释放簇和质子供体的pKa测定

pKa的测定原理是酸碱滴定,蛋白用溶剂(100 mmol/L NaCl,20 mmol/L KCl,pH 7)重悬,初始pH值7,调节蛋白溶液的酸碱度再对样品进行可见光吸收光谱扫描,获得不同pH值下的吸收光谱,将每个pH扫描的吸收光谱减初始pH 7的吸收光谱得到差谱,差谱中吸收最大值作为纵坐标,pH作为横坐标,作图得到滴定曲线,利用Henderson-Hasselbalch公式[29]y=A2+(A1-A2)/[1+10n(x-pK)]进行拟合分析,得到相对应的pKa值。质子受体是从中性向酸性滴定,质子释放簇和希夫碱是从中性向碱性滴定。质子供体的pKa测定方法略有不同,从中性向碱性滴定,在不同pH值下测定M态和O态的信号,以O/M的强度比值随pH变化作图,得到质子供体的滴定曲线,再进行拟合分析。

2 结果与分析

2.1 突变体鉴定及分子质量测定

突变体重组质粒经基因测序比对后显示突变位点已突变,其中与pNor载体重组后的质粒双酶切后检测的电泳结果如图 1,目的片段约1 200 bp,表明突变体pNor表达质粒构建成功。将突变体质粒转化到嗜盐杆菌后,重组野生型和突变蛋白用SDS-PAGE法检测分子质量,结果见图 2。bR和aR4蛋白的分子质量约26 ku,在H.sp. L33和H.sp. MPK409菌株膜上几乎只存在视紫红质膜蛋白,电泳图中显示一条特异性带,表明蛋白分子质量正确。

1:L93A-bR;2:L93F-bR;3:L93T-bR;4:BE-L94A-aR4;5:BE-L94F-aR4;6:BE-L94T-aR4;M:Marker。图1 突变体重组质粒的酶切检测Figure 1 Enzyme digestion detection of the recombinant plasmids of the mutants

1:RC-bR;2:L93A-bR;3:L93F-bR;4:L93T-bR;5:BI-RC-aR4;6:BI-L94A-aR4;7:BI-L94F-aR4;8:BI-L94T-aR4;9:BE-RC-aR4;10:BE-L94A-aR4;11:BE-L94F-aR4;12:BE-L94T-aR4; M:Marker。图2 蛋白的SDS-PAGE分析Figure 2 SDS-PAGE analysis of proteins

2.2 紫外-可见光吸收光谱

图3是重组野生型蛋白与相应突变体在光适应(light adaptation, LA)与暗适应(dark adaptation, DA)的吸收光谱,表 3是最大吸收峰值汇总。L93突变为丙氨酸(alanine, A)、苯丙氨酸(phenylalanine, F)、苏氨酸(threonine, T)后视黄醛在光适应态与暗适应态的最大吸收波长均蓝移,与文献[23,27,30]中变化结果一致。由表 3可知,光适应态时,相比RC-bR,L94突变为A、T后蓝移约30 nm,突变为F后蓝移22 nm;暗适应态时,相比RC-bR,L94突变为A、T后蓝移约20 nm,突变为F后蓝移13 nm。BI-aR4体系中虽然视黄醛的特征吸收峰被菌红素的三重峰掩盖而无法确认,但视黄醛的吸收特征发生变化也会影响菌红素的三重峰,L94突变为A、F、T后菌红素的第二和第三峰蓝移,间接证明视黄醛蓝移。BE-aR4体系中L94突变后视黄醛在光适应态与暗适应态的最大吸收波长也发生蓝移。不论是光适应态还是暗适应态,与BE-RC-aR4相比,L94突变为A、T后蓝移约20 nm,突变为F后蓝移约17 nm。综上,L93/L94突变体与发色团结合成功,且视黄醛均蓝移,在bR/aR4中L93/L94对视黄醛吸收特性的作用上有相似性。

(a): bR体系;(b): BI-aR4体系;(c): BE-aR4体系。图3 bR和aR4重组野生型蛋白及相应突变体蛋白的光、暗适应态紫外-可见光吸收光谱Figure 3 UV-Vis absorption spectra of the light-adapted and dark-adapted recombinant wild-type bR and aR4, and the corresponding mutants

表3 光适应和暗适应态bR和aR4重组野生型及突变体蛋白的紫外-可见最大吸收值Table 3 The maximum UV-Vis absorption wavelength in light and dark adaptation of the recombinant wild-type proteins bR and aR4, and the corresponding mutants

2.3 M态、O态、基态的动力学行为及质子泵

在中性条件下bR和aR4重组野生型蛋白与相应突变体的M态、O态和基态的动力学曲线以及质子泵检测曲线见图 4,中间态的动力学轨迹多指数函数拟合结果见表 4。图4(d)和(g)显示,bR中L93突变后O态形成和衰减变慢,基态恢复变慢,光循环变慢的趋势与文献[23]中研究结果相似。与RC-bR相比,突变为A、T后光循环最慢,O态衰减延长倍数达70倍,基态衰减延长倍数达85倍,其中基态可能由于速率太慢导致呈现为单一组分。而突变为F后O态衰减延长倍数较小,约为RC-bR的20倍。图4(e)和(h)显示,BI-aR4体系中L94突变后O态衰减(慢组分)和基态恢复均变慢,相比BI-RC-aR4,突变为A和T后的O态衰减延长较多约为10倍,而突变为F后延长较少约为3倍,与bR中结果相似。O态是视黄醛再异构化的过程,表明BI-aR4体系中L94与bR体系中L93对视黄醛再异构化的作用相似。不同的是BI-aR4体系中L94突变后O态衰减呈双组分,可能是N中间态特征吸收波长与发生蓝移后的O态相近,导致动力学测量结果中包含了少量的N态信号,慢组分是代表了O态的衰减时间常数。此外,3种突变造成O态衰减延长的倍数较bR体系小,且图4(a)和(b)显示,BI-aR4体系L94突变为F后M态衰减变慢,与bR体系结果不同,表明在bR与aR4中L93和L94对光循环的调控有差异。图4(f)显示BE-aR4体系中L94突变为A、T、F后的O态的衰减也会延长,意味着在菌红素缺失的情况下L94仍对视黄醛的再异构化有调制作用。图4(j)～(l)质子泵功能检测结果表明,L93/L94突变体的质子泵功能完好。图4(j)显示bR中L93突变会造成质子泵功能减弱,质子释放变慢,变为先吸收再释放,突变为A和T后质子释放最慢。图4(k)和(l)显示,BI-aR4体系和BE-aR4体系中L94突变均会导致功能减弱,质子泵方向不变,但质子释放变慢,突变为A和T后质子释放最慢。表明L93与L94均在质子释放过程中有重要作用。

(a)～(c):M态;(d)～(f):O态;(g)～(i):基态;(j)～(l):质子泵检测曲线。图4 在中性条件下bR和aR4重组野生型蛋白与相应突变体的光循环及质子泵动力学轨迹Figure 4 Under neutral conditions, photocycle and proton pumping kinetic curves of the recombinant wild-type bR and aR4, and the corresponding mutants

表4 bR和aR4重组野生型蛋白与相应突变体的动力学中间态衰减常数拟合结果Table 4 Time constants by the best fitting of the multi-exponential function of the recombinant wild-type bR and aR4, and the corresponding mutants

2.4 质子传输通道上关键位点的pKa测定

在bR和aR4中质子的传输是由希夫碱(SB)、质子受体(D85/D86)、质子释放簇(PRC)和质子供体(D96/D97)等关键位点共同调节完成的,这些关键位点的pKa值变化反映自身的质子亲和力,pKa值变大意味着质子亲和力增强,反之则代表质子亲和力减弱[31-33]。图5～图7分别为bR体系、BI-aR4体系、BE-aR4体系蛋白质子传输中这4个关键位点的pH滴定曲线及对应的拟合pKa值。

(a)～(d):SB;(e)～(h):D85;(i)～(l):PRC;(m)～(p):D96。图5 L93A-bR, L93F-bR和L93T-bR突变体及重组野生型蛋白的滴定曲线和拟合结果Figure 5 pH titration curves and best fitting results of L93A-bR, L93F-bR, and L93T-bR mutants, and the corresponding recombinant wild-type protein

在bR和BI-aR4体系中L93/L94突变后D96/D97的pKa变化较小[图5(m)～(p)与图 6(m)～(p)],但却导致D85/D86的pKa升高至少1.4/1.2个单位[图5(e)～(h)与图 6(e)～(h)],以及PRC的pKa降低至少0.3/0.7个单位[图5(i)～(l)与图6(i)～(l)],表明L93/L94对胞外侧的质子传输有重要作用。BE-aR4体系与BI-aR4体系不同,L94突变后PRC的pKa升高约1个单位[图7(i)～(l)],D97的pKa至少升高0.5个单位[图7(m)～(p)],其中突变为A、F后升高1个单位,PRC和D97两个位点的质子亲和力均增强,意味着菌红素可能与L94之间存在联系,并且这种联系影响L94在质子传输过程中的作用。总之,L93/L94突变均会导致bR/aR4中质子传输通道上关键位点的极性发生变化,表明这一位点对质子传输过程中蛋白构象有调控作用。

(a)～(d):SB;(e)～(h):D86;(i)～(l):PRC;(m)～(p):D97。图6 BI-L94A-aR4, BI-L94F-aR4和BI-L94T-aR4突变体及重组野生型蛋白的滴定曲线和拟合结果Figure 6 pH titration curves and best fitting results of BI-L94A-aR4, BI-L94F-aR4, and BI-L94T-aR4 mutants, and the corresponding recombinant wild-type protein

(a)～(d):SB;(e)～(h):D86;(i)～(l):PRC;(m)～(p):D97。图7 BE-L94A-aR4, BE-L94F-aR4和BE-L94T-aR4突变体以及重组野生型蛋白的滴定拟合曲线和拟合结果Figure 7 pH titration curves and best fitting results of BE-L94A-aR4, BE-L94F-aR4, and BE-L94T-aR4 mutants, and the corresponding recombinant wild-type protein

3 讨论

本文将bR和aR4中的对应位点L93和L94分别突变为空间位阻不同的丙氨酸和苯丙氨酸以及极性不同的苏氨酸,以L93在bR中的功能机制作为对比研究L94在aR4中的作用,并通过含菌红素和缺失菌红素两种aR4蛋白对比研究L94与菌红素之间的联系。

在bR中,L93突变后视黄醛在光适应与暗适应下均发生蓝移,表明all-trans和13-cis视黄醛构型更扭曲,多烯链的共轭性均变得更差。其中突变为侧链小的A、T蓝移较大,突变为含苯环的F蓝移较小,这可能是突变为A、T后离视黄醛的C13甲基较远,对视黄醛的调控作用减弱甚至消失,而F由于苯环较大还存在一定调控作用,如图 8(a)所示,表现在光循环中O态衰减延长,且突变体中视黄醛的最大吸收波长蓝移越多,O态的衰减延长程度越大,表明L93会通过侧链的空间位阻调控视黄醛构型和视黄醛的再异构化反应,与现有研究结论一致[23-24]。L93突变还会导致蛋白构象发生变化,尤其是螺旋C和螺旋G,由此影响质子传输[26]。如图 8(b)所示,SB和D85分别与同一个水分子Wat402形成氢键,在SB下方形成一个五边形氢键网络,D85的pKa升高意味着其极性增强,D85-O…H氢键变短,这会拉扯Wat402位移导致其与SB变远,造成SB极性降低,但由于视黄醛整体扭曲较大使SB向Wat402的方向位移,最终造成SB的pKa不变。此外,突变会通过螺旋C和螺旋G的扰动进一步影响胞外侧区,如图 8(c)所示,L93A突变体的O态中螺旋C和螺旋G的胞外部分及PRC附近环境与野生型M态相似[27],而M态是SB将质子传递给D85及PRC向胞外侧释放质子的关键中间态。L93突变后M态衰减变快,质子泵方向翻转变为先吸收再释放,在M态没有释放质子,表明质子释放与M态的耦合作用减弱。D85质子化后,与其有静电作用的R82侧链向下翻转,使PRC氢键网络发生变化释放质子[34],推测L94突变后D85极性增强,导致其与R82之间的静电作用减弱,使R82介导的D85到PRC之间质子传递信息受阻,最终造成质子释放变慢。此外,pKa测定结果显示,L93突变对D96的极性影响较小,进一步表明质子释放变慢是质子泵方向翻转的主要原因。

(a)93位点残基与视黄醛的空间位置(PDB code: 1C3W);(b)野生型bR基态的质子通道(PDB code: 1C3W);(c)L93A-bR的O态(PDB code: 3VI0,浅紫色)和野生型bR的M态(PDB code: 2ZZL,黄色)质子通道叠加。图8 键合区残基和质子通道示意图Figure 8 Schematic diagram of the retinal binding pocket residues and proton transport channel

在BI-aR4体系中,对视黄醛和光循环,L94突变为A、F、T后视黄醛均蓝移,O态衰减变慢,基态恢复变慢,与bR体系中L93突变结果相似,意味着L94会影响视黄醛的吸收特性及光循环后期变化。这一位点空间位阻改变使键合区空腔变得松散,导致视黄醛发生再异构化受阻,表明L94具有调控视黄醛构型及保证视黄醛从13-cis向all-trans快速再异构化作用。不同的是L94突变对视黄醛构型及异构化造成的影响小于L93突变,这是两者氨基酸组成及结构不同的影响。L94突变为F后M态衰减变慢,与A、T的突变影响不同,并且与bR中L93突变为F的影响也不同。目前aR4的晶体结构还未解析,将与aR4同源性高达97%的aR2和bR的晶体结构进行比对(图 9),发现aR2中K217的主链部分与视黄醛的距离稍远,将L94突变为F后,苯环可能使K217主链部分进一步远离视黄醛,造成SB位移,使其参与的五边形氢键网络发生干扰,导致M态衰减变慢。pKa测定实验结果表明,在胞外侧质子传输通道上,L94突变后SB的pKa降低,质子受体D86的pKa升高,PRC的pKa降低,与L93突变的结果相似。针对aR4先吸收后释放的质子传输时序,Ming等[15]提出了弱偶联机制,他们认为由于两者结构及组成的差异使aR4进入光循环后PRC的pKa降低程度小,与D86之间的偶联关系弱,导致质子释放变慢。根据bR中L93突变的螺旋结构变化,猜测在BI-aR4体系中L94突变同样造成螺旋C和螺旋G发生扰动,使D86与PRC之间的弱偶联作用变得更弱,最终造成质子释放变慢。综合表明,L94可以通过对螺旋的扰动参与质子的释放。

野生型bR(PDB code: 1C3W,视黄醛为紫色,氨基酸为湖蓝色)与野生型aR2(PDB code: 2Z55,视黄醛为绿色,氨基酸为白色)的视黄醛键合区残基叠加,为便于理解图中aR2的氨基酸序列以aR4序列标记。图9 视黄醛键合区示意图Figure 9 Schematic diagram of the retinal binding pocket

在缺失菌红素的BE-aR4体系中,L94突变会使视黄醛最大吸收波长蓝移且再异构化速率变慢,意味着菌红素缺失的情况下L94仍对视黄醛的吸收特性和异构化有调控作用。aR4同家族成员aR3的变体ArchT具有较大蓝移,是目前在光遗传学工具应用最广的光驱质子泵蛋白之一,可以在神经元内缺少菌红素的情况下以单体形式大量表达,能够抑制神经元动作电位的产生[35-36]。而在bR/aR4中L93/L94突变为空间位阻小的丙氨酸后蓝移较多且质子泵功能完好,这对光遗传学工具开发具有一定的指导意义,在蛋白定向改造中可尝试在这一位点引入空间位阻较小的如丙氨酸一类的残基。BE-aR4与bR结构类似,L93突变后蛋白内部水分子变多,而菌红素缺失使蛋白结构更松散[14,27]。这可能使L94突变后进入蛋白内部的水分子更多,导致PRC和D97参与的氢键网络发生改变,极性增强。其中,突变为T后D97的pKa变化较A、F小,与水分子变多有关,T的侧链-OH与内部水分子形成氢键,通过氢键网络传递维持了D97原本的质子亲和性,这可能是其质子泵功能最强的原因。

综上,L94在aR4中通过疏水性侧链以空间位阻效应来调控视黄醛键合区构象和螺旋的结构变化,以维持视黄醛顺-反异构比例,保证视黄醛再异构化以较快的速率完成,并稳定螺旋C的结构变化及质子释放速率。此外,L94的作用会受菌红素调制,菌红素的缺失会使L94对蛋白构象影响变强,加剧了对质子传输通道中D97和PRC周围氢键网络的影响。这一研究内容有利于进一步理解aR4的质子传输机制,同时也为研究其他微生物视紫红质中关键残基的功能机制提供基础。