发酵优化绿针假单胞菌GP72-ND3ΔphzO高产吩嗪-1-羧酸

刘桢桢, 王 威, 黄显清, 张雪洪

(上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室, 上海 201100)

吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid,PCA)是重要的吩嗪类次级代谢产物,具有广谱抗菌和环境友好等特点[1]。研究发现多种假单胞菌可以合成PCA,如荧光假单胞菌2-79、铜绿假单胞菌M18、绿针假单胞菌GP72等[1-2]。野生菌株中PCA的产量通常较低,一般在1 g/L以下[3-4]。提高PCA产量的研究多集中在对野生菌株的改造方面,Fang等[5]在铜绿假单胞菌PA1201中敲除负调控PCA合成的基因mvaU,将PCA的产量提高了0.5倍,Song等[6]在针假单胞菌GP72ANO中过表达甘油代谢途径的基因glpF和glpK并阻断分流途径,将PCA的产量提高了2.1倍。关于PCA合成菌株的发酵优化策略的研究则较少,Bedoya等[7]优化铜绿假单胞菌LV的发酵培养基组分、温度和pH值,将PCA的产量提高为113 mg/L,Du等[8]优化铜绿假单胞菌M18UMS1的碳氮源种类及浓度,将PCA的产量提高为4 771 mg/L。

绿针假单胞菌GP72是本实验室从甜椒根际土壤分离得到的一株生防菌株,能合成PCA、2-羟基-吩嗪-1-羧酸(2-hydroxy-phenazine-1-carboxylic acid,2-OH-PCA)、2-羟基-吩嗪(2-hydroxyphenazin,2-OH-PHZ)3种吩嗪类化合物[4]。本实验室参与研究开发的以PCA为主要成分的生物源农药“申嗪霉素”,对水稻纹枯病、西瓜枯萎病、辣椒疫病等都具有良好的防治效果,已注册获得农药准证[9]。该菌株中的单加氧酶基因phzO,可催化PCA羟基化生成2-OH-PCA,而2-OH-PCA可以自发脱羧生成2-OH-PHZ[4,10-11]。前期研究中,通过敲除菌株GP72中的phzO基因以及负调控吩嗪类化合物合成的基因pykF、rpeA、rsmE和lon,获得了工程菌株GP72-ND3ΔphzO,在摇瓶发酵中PCA的产量由22 mg/L提升至2 300 mg/L,是野生菌株的90多倍[4,11]。本文以菌株GP72-ND3ΔphzO为研究对象,在摇瓶水平通过单因素实验、正交实验、最陡爬坡实验和中心组合设计(central composite design,CCD)实验优化PCA的发酵培养基;于1 L反应器中在优化的培养基基础上优化发酵pH值,并在5 L反应器中进行放大培养。研究结果为该菌株应用于工业化生产PCA奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与培养基

绿针假单胞菌GP72-ND3ΔphzO,由本实验室构建并保藏。KB液体培养基:胰蛋白胨20 g/L,甘油18.92 g/L,K2HPO40.514 g/L,MgSO40.732 g/L。KB固体培养基:在KB液体培养基中添加12 g/L琼脂。

1.1.2 主要仪器

紫外分光光度计UV-7504购自上海精密仪器有限公司;高效液相色谱系统购自安捷伦科技(中国)有限公司;1 L反应器及5 L反应器购自迪必尔生物工程(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养方法

固体种子培养:将保存于-80 ℃的菌株划线在KB固体培养基上,28 ℃倒置培养36～48 h后,用接种环挑取单菌落,再次划线在KB固体培养基上,28 ℃倒置培养16 h。

液体种子培养:用接种环挑取固体种子单菌落,接种于含有60 mL KB液体培养基的250 mL凹角三角瓶中,200 r/min、28 ℃恒温条件下培养12 h。

摇瓶发酵:将液体种子按照1%的接种量接种于含有60 mL KB液体培养基的250 mL凹角三角瓶,200 r/min、28 ℃恒温条件下培养,每隔12 h取样,每个条件设置3个平行样。

1 L反应器发酵:将液体种子培养基按照6%的接种量接种于含有600 mL优化培养基的1 L反应器中,设置转速700 r/min、通气量2 vvm,28 ℃恒温培养,每隔12 h取样,每个条件设置3个平行样。

5 L反应器发酵:将液体种子培养基按照6%的接种量接种于含有3 L优化培养基的5 L反应器中,设置通气量3 vvm、转速460 r/min,pH根据优化结果设置,28 ℃恒温培养,每隔12 h取样,每个条件设置3个平行样。

1.2.2 培养基优化

(1)碳源对PCA产量的影响。以KB培养基为基准,考察碳源种类和浓度对PCA产量的影响。在18.92 g/L的碳源起始浓度下,考察葡萄糖、甘油、淀粉和乙醇等4种碳源对PCA产量的影响;在15、20、25、30、35 g/L起始浓度下,考察碳源浓度对PCA产量的影响。

(2)氮源对PCA产量的影响。以KB培养基为基准,考察氮源种类和浓度对PCA产量的影响。在20 g/L的氮源起始浓度下,考察大豆蛋白胨、胰蛋白胨、棉籽粕、棉籽饼粉、黄豆饼粉、冷榨棉籽、牛肉膏、鱼粉蛋白胨、热榨棉籽、棕榈粕、玉米浆、黄豆粉等12种氮源对PCA产量的影响;在10、20、30、40、50 g/L起始浓度下,考察氮源浓度对PCA产量的影响。

(3)无机盐对PCA产量的影响。根据预实验确定KCl、MgSO4、K2HPO4等3种考察对象和浓度范围。去除KB培养基所有无机盐,在0、3、6、9 g/L起始浓度下,考察KCl浓度对PCA产量的影响。去除KB培养基所有无机盐,在0、0.5、1、1.5 g/L起始浓度下,考察MgSO4浓度对PCA产量的影响。去除KB培养基所有无机盐,在0、0.3、0.6、0.9 g/L起始浓度下,考察K2HPO4浓度对PCA产量的影响。

(4)正交实验。根据单因素实验结果,以X1-甘油(15～25 g/L)、X2-大豆蛋白胨(10～20 g/L)、X3-KCl(0～3 g/L)、X4-MgSO4(0～1.5 g/L)和X5-K2HPO4(0～0.3 g/L)等5个因素为自变量,以发酵液中PCA含量为响应值,选用L8正交表设计作为正交实验筛选的变量,从中筛选显著影响因素。其中每个因素取2水平:高水平“1”为范围区间最大值,低水平“-1”为范围区间最小值。正交实验的具体因素和水平见表 1。

(5)最陡爬坡实验。根据正交实验的一阶模型,筛选出大豆蛋白胨、甘油、KCl和K2HPO4共4个显著因素,在考虑交叉项的基础上根据显著因素的系数值确定最陡爬坡方向及步长[12]。最陡爬坡的方向是响应值增长最迅速的方向,爬坡路径的步长与回归系数成正比。显著因素的爬坡路径从正交实验的中心点开始并沿着爬坡方向和步长移动,非显著因素的浓度保持在中心点,找出PCA产量最大时的显著因素的浓度,作为中心组合设计实验的起始中心点。最陡爬坡实验的具体因素和水平见表 3。

(6)中心组合设计实验。利用响应面实验可以评价显著因子之间的交互作用,以最陡爬坡实验结果作为中心点,以甘油、大豆蛋白胨和K2HPO4为自变量,以PCA产量为响应值,设计中心组合设计实验。三因素的中心组合设计中各因素的水平点共有5个(-1.682、-1、0、1、1.682),实验组共20组,具体因素和水平见表 4。

1.2.3 pH对PCA产量的影响

根据中心组合设计实验得到的最佳发酵培养基组分,在1 L反应器中,设置恒定pH值分别为6.4、6.8、7.2、7.6,考察发酵pH值对PCA产量的影响。

1.2.4 5 L反应器的放大培养

根据1 L反应器pH的优化结果,在5 L反应器中进行放大培养,同时与1 L反应器中的进行比较,考察不同规模反应器中菌株生长和PCA合成的情况。

1.2.5 PCA产量的测定

发酵液中PCA的提取和含量测定参照文献[6]的方法。取发酵液1 mL,加入50 μL 6 mol/L盐酸酸化后,加入9 mL乙酸乙酯振荡萃取5 min,取1 mL萃取液吹干后加入2.5 mL乙腈溶解,以HPLC检测。

HPLC检测条件:使用Agilent C18(250×4.6 mm, 5 μm)色谱柱,流动相为乙腈和0.1%甲酸水,流动相比例:0～4 min,20%乙腈-80%甲酸水,4.01～20 min,乙腈浓度由20%升至40%,甲酸水浓度由80%下降至60%,20.01～25 min,20%乙腈-80%甲酸水。检测波长254 nm,柱温25 ℃,流速1.0 mL/min。

1.3 数据统计分析

每个实验独立重复2次以上,每次实验中每个实验组平均重复3次,以“平均值±标准差”形式表示结果。在单因素实验中,使用Graphpad Prism 8.0软件处理分析实验数据并作图,正交实验及中心组合实验设计使用R-4.0.3及minitab 19处理分析。使用单向方差分析(one-way ANOVA)分析组间差异性,使用F检验(P=0.01或P=0.05)确定显著差异。

2 结果与分析

2.1 碳源对PCA产量的影响

菌株GP72-ND3ΔphzO用不同碳源发酵60 h后,PCA的产量见图 1(a)。可以看出,以甘油作为碳源时,PCA的产量最高达到(2.44±0.09) g/L;以葡萄糖作为碳源时,PCA的产量低于甘油为(1.87±0.06) g/L;以淀粉和乙醇作为碳源时,PCA的产量极低仅为(0.27±0.03) g/L和(0.17±0.03) g/L。菌株GP72-ND3ΔphzO以不同甘油浓度发酵60 h后,PCA的产量见图 1(b)。结果显示,随着甘油添加量的增加,PCA产量先升高后降低,且甘油的添加量为30 g/L时,PCA产量达到最高为(4.15±0.38) g/L,但进一步提高甘油浓度PCA产量下降,因此选择添加量为30 g/L的甘油为最佳碳源。

* 为显著差异(P<0.05);** 为较显著(P<0.01)。图1 碳源种类和甘油浓度对PCA产量的影响Figure 1 Effects of carbon sources and glycerol concentration on PCA production

2.2 氮源对PCA产量的影响

菌株GP72-ND3ΔphzO用不同氮源发酵60 h后,PCA的产量见图 2(a)。结果显示:以大豆蛋白胨作为氮源时,PCA的产量最高达到(3.03±0.03) g/L;以胰蛋白胨作为氮源时,PCA的产量低于大豆蛋白胨为(2.44±0.09) g/L;以棉籽粕、棉籽饼粉、黄豆饼粉、冷榨棉籽、牛肉膏、鱼粉蛋白胨、热榨棉籽、棕榈粕、玉米浆及黄豆粉作为氮源时,PCA的产量均不足2 g/L。因此选择大豆蛋白胨作为最优氮源。菌株GP72-ND3ΔphzO以不同大豆蛋白胨浓度发酵60 h后,PCA的产量见图 2(b)。结果显示,大豆蛋白胨的添加量为10 g/L时,PCA产量仅1 g/L,可能是氮源不足导致菌株合成PCA受限,而当大豆蛋白胨的添加量为20 g/L时,PCA产量达到最高为(3.44±0.08) g/L,随着大豆蛋白胨的添加量进一步增加PCA产量逐渐降低,因此选择添加量为20 g/L的大豆蛋白胨为最佳氮源。

(a)中1:大豆蛋白胨;2:胰蛋白胨;3:棉籽粕;4:棉籽饼粉;5:黄豆饼粉;6:冷榨棉籽;7:牛肉膏;8:鱼粉蛋白胨;9:热榨棉籽;10:棕榈粕;11:玉米浆;12:黄豆粉。图2 氮源种类和大豆蛋白胨浓度对PCA产量的影响Figure 2 Effects of nitrogen sources and soy peptone concentration on PCA production

2.3 无机盐对PCA产量的影响

菌株GP72-ND3ΔphzO以不同KCl浓度发酵60 h后,PCA的产量见图 3(a)。结果显示,KCl的添加对菌株合成PCA产量具有显著影响,且KCl的添加量为3 g/L时,PCA产量达到最高为(1.99±0.02) g/L,因此选择添加量为3 g/L的KCl进行后续优化。菌株GP72-ND3ΔphzO以不同MgSO4浓度发酵60 h后,PCA的产量见图 3(b)。结果显示,MgSO4的添加有利于提高菌株合成PCA产量,且MgSO4的添加量为1.5 g/L时,PCA产量达到最高为(2.01±0.08) g/L,因此选择添加量为1.5 g/L的MgSO4进行后续优化。菌株GP72-ND3ΔphzO以不同K2HPO4浓度发酵60 h后,PCA的产量见图 3(c)。结果显示,K2HPO4对菌株合成PCA产量具有显著影响,且K2HPO4的添加量为0.3 g/L时,PCA产量达到最高为(2.85±0.07) g/L,因此选择添加量为0.3 g/L的K2HPO4进行后续优化。

(a)KCl浓度对PCA产量的影响;(b)MgSO4浓度对PCA产量的影响;(c)K2HPO4浓度对PCA产量的影响。* 为显著差异(P<0.05);** 为较显著(P<0.01);**** 为极显著(P<0.000 1)。图3 不同无机盐的添加及浓度对PCA产量的影响Figure 3 Effects of addition and concentration of different inorganic salts on PCA production

2.4 正交实验

正交实验设计及结果见表1。对正交结果进行分析,X4-MgSO4的P值为0.011 56,大于0.01,说明其对PCA产量无明显影响;其余4个因素的P值均小于0.001,说明这4个因素对PCA的产量具有显著影响。为得到更准确的影响作用,在考虑交叉项的情况下对具有显著作用的4个因素进行回归分析(表2),结果表明该模型能够较为显著地拟合实验数据(P<0.001),且R2=0.948 2表明Y的变化有94.82%能被回归方程解释,该模型拟合度较好。X1-甘油,X2-大豆蛋白胨和X5-K2HPO4等3个因素对PCA产量有显著促进作用,X3-KCl对PCA产量有显著作用但影响因子为负,对结果进行拟合得到回归方程。

表1 正交实验设计及结果Table 1 Design and results of orthogonal design experiment

表2 正交实验结果的回归分析Table 2 Regression analysis results of orthogonal design experiment results

2.5 最陡爬坡实验

根据正交实验拟合曲线方程中各显著因素系数计算最陡爬坡方向和步长。由于KCl的系数为负值,在爬坡过程中添加量逐渐降低至0,且通过预实验对比发现KCl以单因素最优值添加时PCA产量更高,故KCl以1.5 g/L恒定添加,爬坡实验考察甘油、大豆蛋白胨和K2HPO4等3个影响因素。最陡爬坡以(1.46,3.23,1)为编码方向,即K2HPO4每爬坡1步,对应着甘油爬坡1.46步、大豆蛋白胨爬坡3.23步。各因素的初始值分别是甘油20 g/L、大豆蛋白胨15 g/L、K2HPO40.15 g/L,爬坡一步分别增加7.28、16.14、0.15 g/L,爬坡实验设计及结果见表 3。爬坡1.5步时PCA的产量达到最高,为(5.49±0.44) g/L,因此选择该组每个因素的水平作为响应面实验的中心点,即甘油30.92 g/L、大豆蛋白胨39.20 g/L、K2HPO40.38 g/L。

表3 最陡爬坡实验设计及结果Table 3 Design and results of steep climbing experiment

2.6 中心组合设计实验

基于响应面实验方法,通过中心组合设计实验对3个主要因素甘油(X1)、大豆蛋白胨(X2)和K2HPO4(X3)进一步优化,中心组合设计实验设计及结果见表 4,分析结果见表 5。

表5 中心组合设计回归分析结果Table 5 Regression analysis results of central combination design

由表5可知,模型的F值为28.41,P<0.000 1,说明该模型能够较为显著地拟合实验数据;失拟项F值为0.732 3,P>0.05,失拟项不显著。模型R2为0.809 9,表明Y的变化有80.99%能被回归方程解释,表明该模型拟合度较高。应用R语言进行预测确定甘油、大豆蛋白胨和K2HPO4的最优值分别为49.55 g/L、37.34 g/L和0.225 g/L,PCA产量预测值为5.79 g/L;发酵验证得PCA产量为(6.01±0.17) g/L,符合模型预测。

2.7 pH对PCA发酵产量的影响

发酵pH会影响PCA的生物合成,因此在最优培养基下,探究菌株GP72-ND3ΔphzO以不同pH值在1 L反应器中发酵时的菌株生长状况和PCA产量。菌株生长曲线见图 4 (a),发酵恒定pH值由6.4升高至7.2过程中,随着pH值升高菌株生长更快,且前48 h菌株OD值不断升高,48 h后菌株OD值缓慢降低;发酵恒定pH值为7.6时,较其他实验组菌株生长明显更缓慢,且菌株OD值不存在先升高后降低的现象。菌株PCA的产量见图 4(b),当pH值为6.4时,前24 h菌株合成PCA速率与pH值为6.8和7.2时相当,随后菌株合成PCA速率变缓,发酵72 h后PCA最终产量为(4.26±0.41) g/L;当pH值为6.8和7.2时,前48 h菌株合成PCA速率相当且在所有实验组中最快,且pH值为6.8时菌株在72 h时PCA积累量达最高,为(7.15±0.04) g/L,较pH值为7.2时PCA产量提高了1.12 g/L;当pH值为7.6时,菌株合成PCA速率及积累量显著低于其他实验组,可能是碱性环境限制了菌株生长从而导致PCA产量较低。

(a)菌株生长;(b)PCA产量。图4 不同pH值菌株生长和PCA产量的动态曲线Figure 4 Effect of different pH on strain growth and PCA production

2.8 5 L反应器放大培养

以优化培养基为基础,控制发酵pH值恒定为6.8,探究菌株GP72-ND3ΔphzO在不同反应器水平发酵的情况,菌株生长及PCA产量曲线见图 5。结果显示,随着反应器的放大,菌株生长更慢,PCA开始合成的时间延迟。但48 h时二者PCA产量几乎持平,并且均在60 h达到PCA最高产量,其中,5 L反应器中的产量为(6.84±0.55) g/L,1 L反应器中产量(6.71±0.07) g/L。5 L反应器中产量略高于1 L反应器中产量,表明该发酵优化策略的放大培养可以有效进行。

(a)菌株生长;(b)PCA产量。图5 1 L和5 L反应器中菌株生长和PCA产量的动态曲线Figure 5 Strain growth and PCA production in 1 L and 5 L bioreactors

3 讨论与结论

假单胞菌以其能分泌多种抗菌作用物质而广泛运用于农业生产中,目前研究对假单胞菌分泌的吩嗪类物质PCA合成与调控机制深入研究,并采用多种策略从基因调控水平进行了优化,而涉及发酵水平的优化不多,因此探究假单胞菌发酵条件对提高PCA产量及工业化具有重要意义。

本文研究绿针假单胞菌GP72-ND3ΔphzO生产PCA的最优发酵条件。首先,在摇瓶水平进行培养基成分的优化。通过单因素实验确定大豆蛋白胨、甘油、KCl、MgSO4和K2HPO4等5种组分作为PCA发酵培养基,并研究各因素的最优添加量。随后,通过正交实验筛选了对PCA合成具有显著影响的4个因素:大豆蛋白胨、甘油、KCl和K2HPO4,正交实验最优组PCA产量为(2.85±0.07) g/L;通过最陡爬坡实验确定PCA增长最迅速的方向并进一步优化显著因素的添加量,最优组PCA产量大幅提高为(5.49±0.44) g/L。接着,通过中心组合设计实验确定了显著因素的最优添加量:甘油49.55 g/L、大豆蛋白胨37.34 g/L和K2HPO40.225 g/L。菌株最优发酵培养基组分:甘油49.55 g/L、大豆蛋白胨37.34 g/L、KCl 1.5 g/L、MgSO40.75 g/L和K2HPO40.225 g/L。以最优培养基进行摇瓶发酵,60 h时PCA产量达到(6.01±0.17) g/L,较优化前的2.30 g/L提高了1.6倍。完成摇瓶水平优化后,在1 L反应器中以最优培养基为基础对菌株发酵过程的pH进行优化,当培养过程pH值维持在6.8时,PCA的产量最高,为(7.16±0.04) g/L,是优化前的1.2倍。最后,在最优培养基和pH条件下,对菌株在5 L反应器中进行了放大培养,发酵60 h后PCA的最大产量为(6.84±0.53) g/L,和1 L反应器中的产量相当,约为优化前摇瓶产量的3倍。

在前期报道中,大多研究通过菌株改造提高PCA产量,如Askitosari等[13]构建恶臭假单胞菌14.phz2将PCA产量提高为79.79 mg/L,Sun等[14]改造铜绿假单胞菌PA1201将PCA产量提高为300 mg/L。进行发酵优化的研究主要针对铜绿假单胞菌,本研究的优化产量为6.84 g/L,高于大多数研究[7-8],仅低于Jin等[3]改造的铜绿假单胞菌工程株PA-IV在5 L反应器中优化的9.88 g/L。与Jin等[3]的研究相比,本研究优化后摇瓶产量与其相当,且PCA产量达到最大值时间提前为60 h,因此后续可以通过分批补料等发酵策略提升在5 L反应器中生产效率。此外,本研究出发菌株为生防菌株绿针假单胞菌,生物安全性较高。本研究为绿针假单胞菌GP72-ND3ΔphzO工业化生产PCA提供支持,促进其在农业领域的应用发展。