TAP酞菁锌光敏剂对大肠杆菌的抗菌活性

鄢树枫, 廖晓云, 师 琪, 吴汉钦, 黄晓晨

(1. 三明学院资源与化工学院, 三明 365004; 2. 中国科学院福建物质结构研究所, 福州 350002)

抗生素的不合理应用等问题导致细菌、真菌产生耐药性,引发更严峻的抗菌形势。抗菌治疗的难度提升不仅严重影响疾病的治疗,还对人类的生命健康造成威胁[1-4]。光动力疗法是一种新型的抗菌治疗方法,主要是利用光敏药物在含氧条件下能够被特殊波长的光激发,产生能杀伤细菌的单线态氧。相比传统的抗菌方式,光动力疗法是一种高效、新颖的抗菌疗法,在科研和临床上都有较广泛的探索和应用[5-8]。光动力抗菌效果与所用光敏剂密切相关,不同类别的光敏剂在物理化学性能、激发波长、单线态氧产率、组织清除时间和纯度等方面各不相同。虽然已被报道的光敏剂种类繁多,但迄今为止仅有少数几种光敏剂得到官方批准上市应用,主要原因在于光敏剂的抗菌效果等方面有待深入探索,光敏剂相关抗菌产品有待深入开发和应用[9-12]。TAP酞菁锌光敏剂由酞菁锌和TAP(12个二甲氨甲基基团)制备合成,已被证实能够产生丰富的单线态氧产量从而发挥光动力作用[13-14]。

本文选取TAP酞菁锌光敏剂,在前期化学合成的基础上,通过紫外检测法测定大肠杆菌的生长曲线图,确定大肠杆菌最适生长期;紫外光谱法测定TAP酞菁光敏剂的紫外-浓度标准曲线;稀释涂板法、试剂盒检测法和探针法等研究TAP酞菁锌光敏剂对大肠杆菌的抗菌作用,以期为光动力抗菌产品的开发和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

2,4,6-三(二甲氨甲基)苯酚、2,7-二氯荧光素二乙酸酯DCFH-DA、N,N-二甲基硫脲DMT等购自阿尔法化工有限公司和西格玛奥德里公司;CCK-8试剂盒、LB培养基配制试剂等抗菌分析试剂和材料购自上海碧云天生物科技有限公司。本文选取最常用于抗菌实验研究的大肠杆菌ATCC 25922(Escherichiacoli. ATCC 25922)标准菌株作为TAP光敏剂抗菌研究的实验菌,该菌由中国科学院福建物质结构研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化和菌种保存

将冻存于-80 ℃冰箱的大肠杆菌(15%甘油冻存菌)取出并复苏,置于超净台备用。于超净台无菌环境下,吸取上述冻存菌30 μL,接种于3 mL LB培养基试管,振荡使其充分混匀。将试管置于37 ℃振荡培养过夜,隔天进行保菌。同时取培养过夜的大肠杆菌按1∶100的比例扩大培养,取0.5 mL菌液接种于50 mL 灭菌的LB培养基中,振荡培养过夜。

1.2.2 大肠杆菌生长曲线(OD600)测定

取30 μL冻存的大肠杆菌甘油菌,加至3 mL灭菌的LB试管液体培养基中,37 ℃摇床恒温培养过夜(约16 h)。隔天,吸取500 μL上述菌液接种于100 mL LB培养基,以0 h为起点,前5 h每隔1 h利用紫外分光光度计测定一次OD600值,待数据趋稳后每隔2 h测定一次,共记录24 h,以2 mL的空白LB培养基作为对照,并设定3组平行实验,绘制大肠杆菌的生长曲线图,分析其对数生长期。

1.2.3 TAP酞菁锌光敏剂紫外-浓度标准曲线测定

依据文献[13-14],合成足够量TAP酞菁锌光敏剂,其具有12个二甲氨甲基集团,溶解于6%乙醇水溶液(1 mg/mL对应浓度为613 μmol/L),本实验所用的TAP光敏剂浓度范围内,相应对照组均设置为与实验组同浓度的乙醇含量,以减少实验误差。吸取适量TAP酞菁锌光敏剂到 1.5 mL EP 管中,调整其终浓度为 10 μmol/L。用蒸馏水加入到比色皿中作为对照组,将光敏剂样品倒入另一比色皿中,经擦镜纸擦拭后利用紫外分光光度计测量其 650 nm 处的紫外吸收值。采用2倍梯度稀释法,取 0.75 mL 前述光敏剂溶液于新的 1.5 mL EP 管中,并加入 0.75 mL 无菌水,利用紫外分光光度计在相同波长条件下测该浓度紫外吸收值,并依次稀释和测量全部组别: 10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 3、0.078 1、0.039 1和0.019 5 μmol/L,共计10组。每组不同浓度的光敏剂每次重复测得3组数据并取平均值作为实验数据,绘制TAP酞菁锌光敏剂紫外-浓度标准曲线。

1.2.4 TAP酞菁锌光敏剂对大肠杆菌的抗菌活性

取100 μL冻存的大肠杆菌甘油菌,加入2 mL试管培养基中振荡培养,在OD600值介于0.4～0.5(对数生长期)时可用于抗菌实验。取10 μL大肠杆菌菌液于990 μL PBS缓冲液中稀释100倍。取150 μL稀释后的菌液与不同浓度TAP酞菁锌光敏剂混匀(10、5、2.5、1.25、0.625 μmol/L),置于96孔实验板上,并置于37 ℃恒温培养箱中孵育30 min。用96孔LED平板光源(660 nm红光)照射5 min,并静置15 min后,将混合液与PBS缓冲液按1∶100稀释,取100 μL进行LB固体培养基涂板,平板37 ℃恒温培养16～18 h。隔天观察平板,计算菌落数作为抗菌效果的评价依据。光照采用专一定制的LED平板光源(波长660 nm, 照射距离10 cm),能够保证96孔板上的任一处具有相同的光能量,从而减少实验误差。

1.2.5 TAP酞菁锌光敏剂对大肠杆菌的抗菌活性

细菌活性检测试剂盒 (CCK-8试剂盒法)是应用水溶性四唑盐2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐,从而快速高灵敏度检测细菌活性的比色检测法。四唑盐在电子载体存在的情况下能够被细菌的脱氢酶还原成橙黄色的水溶性的Formazan,生成的Formazan 量与细菌的活性成正比,并通过颜色深浅测定细菌活性,对同类细菌,颜色深浅与细菌活性呈线性关系。取在OD600值介于0.4～0.5(对数生长期)的大肠杆菌用于抗菌实验。取10 μL大肠杆菌菌液于990 μL PBS缓冲液中稀释100倍。取150 μL稀释后的菌液与不同浓度TAP酞菁锌光敏剂混匀(10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.15 μmol/L),置于96孔实验板上,并置于37℃恒温培养箱中孵育30 min,用96孔LED平板光源(660 nm红光)照射5 min,并静置15 min。CCK-8溶液分别加入到各组细菌样品中,根据试剂盒说明书操作并于酶标仪中测定各组在570 nm处的光密度,计算其存活率。

1.2.6 TAP酞菁锌光敏剂对大肠杆菌的抗菌作用方式

采用探针法测定TAP酞菁锌光敏剂对大肠杆菌的抗菌作用方式。选取2,7-二氯荧光素二乙酸酯DCFH-DA作为单线态氧探针,N,N-二甲基硫脲DMT作为氢氧自由基猝灭剂[15]。单线态氧产生能使DCFH-DA转变为DCF(2,7-二氯荧光素),DCF经400 nm波长光激发,在528 nm波长处有特征荧光产生,检测528 nm波长特征荧光的强度可计算单线态氧产量;而DMT可以专一性猝灭单线态氧。设计对照组和实验组,观察TAP酞菁锌光敏剂对大肠杆菌作用前的单线态氧产量及其猝灭情况。设置检测组(TAP+E.coli+DCFH-DA)和猝灭组(TAP+E.coli+DCFH-DA+DMT),检测组的TAP酞菁锌光敏剂设置为5 μmol/L。采用红光进行间断性照射,连续照射5 min,每分钟检测各组在528 nm处的荧光值,作图,分析TAP酞菁锌光敏剂产生的单线态氧量、类型及其对大肠杆菌的光动力降解作用。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌生长曲线及其对数生长期测定

根据实验设计,进行3组大肠杆菌生长曲线测定,由图1可知,大肠杆菌3组生长曲线较为稳定,菌生长各时期相对均一。大肠杆菌常规接种后,约在复苏培养后4 h开始进入对数生长期,在第10 小时接近对数生长期最高峰,此时大肠杆菌活力达到最大,此后菌株生长受限于空间、营养物质消耗等因素进入增长缓慢的平台期,证明常规接种情况下,约10 h大肠杆菌可达对数生长期峰值,具有最佳生长活力。

图1 大肠杆菌生长曲线图Figure 1 Growth curve of E.coli

2.2 TAP酞菁锌光敏剂紫外-浓度标准曲线测定

TAP酞菁锌光敏剂的10个浓度组(10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 3、0.078 1、0.039 1和0.019 5 μmol/L)分别测定其650 nm处的紫外吸收值,对照光敏剂浓度,绘制紫外吸收-浓度标准曲线图。如图2所示,TAP酞菁锌光敏剂在波长 650 nm 的紫外吸光值与其浓度呈正相关,紫外吸光值随着浓度升高逐渐递增,并获得其标准曲线公式y=0.032 2x+0.015 1,有助于后续在TAP光敏剂应用时,通过紫外光谱测定法对其进行精准、快速的定量分析,提高TAP酞菁锌光敏剂在抗菌研究应用的精确度。

图2 TAP酞菁锌光敏剂紫外-浓度标准曲线Figure 2 UV-concentration standard curve of TAP zinc phthalocyanine photosensitizer

2.3 TAP酞菁锌光敏剂对大肠杆菌的抗菌活性

由表1可知,TAP酞菁锌光敏剂对大肠杆菌具有显著的抗菌作用,能够在有限使用浓度范围内杀伤大肠杆菌,并且抗菌效率与TAP酞菁锌光敏剂的使用浓度呈正相关,光敏剂浓度越高,抗菌效果越好。其抗菌效果亦体现于平板菌落结果(图3),与对照组相比,随TAP酞菁锌光敏剂浓度升高,平板上生长的菌落数量逐步减少,并在高浓度组别(10和5 μmol/L)中实现了高效抗菌作用,证明TAP酞菁锌光敏剂是一种强抗菌活力的酞菁锌类光敏剂。

表1 大肠杆菌存活率(涂板法)Table 1 Survival rate of E.coli (coated plate method)

图3 TAP光敏剂对菌落数量的抑制效应(涂板法)Figure 3 Inhibitory effect of photosensitizer on colony number (agar plate method)

2.4 TAP酞菁锌光敏剂对大肠杆菌的抗菌活性

3组平行实验均证明TAP酞菁锌光敏剂对大肠杆菌具有光动力抗菌作用,并且其结果与涂板法测定的抗菌结果相吻合,TAP酞菁锌光敏剂对大肠杆菌的抗菌作用与其浓度呈现正相关,光敏剂浓度越高,其抗菌效果越突出(图4)。用试剂盒法测定的TAP酞菁锌光敏剂对大肠杆菌抗菌活性证明TAP酞菁锌光敏剂浓度达5 μmol/L或以上时,能实现接近100%的抗菌活性,再次证明TAP酞菁锌光敏剂是一种具有较好应用前景的光敏剂,其对细菌的光动力杀伤作用显著,有望进一步开发为系列的光动力抗菌产品。

2.5 TAP酞菁锌光敏剂对大肠杆菌的抗菌作用方式

选取2,7-二氯荧光素二乙酸酯DCFH-DA作为单线态氧探针,N,N-二甲基硫脲DMT作为氢氧自由基猝灭剂,设置检测组(TAP+E.coli+DCFH-DA)和猝灭组(TAP+E.coli+DCFH-DA+DMT)。由图5可知,TAP酞菁锌光敏剂与大肠杆菌结合后,并在660 nm 的LED平板光源照射下产生显著的单线态氧量,其单线态氧量与光照时间(光剂量)呈正比,光照时间增加,单线态氧产量逐步提升。同时,氢氧自由基猝灭组的实验结果证明,DMT存在时其能显著猝灭反应体系产生的自由基,阻止了TAP酞菁锌光敏剂发挥光动力作用,证明TAP酞菁锌光敏剂主要产生氢氧自由基类型的单线态氧,从而产生光动力作用效果。

图5 TAP光敏剂对大肠杆菌的抗菌作用(ROS探针法)Figure 5 Antibacterial mechanism of tap photosensitizer against E.coli (ROS probe)

3 结论

通过实验成功绘制TAP酞菁锌光敏剂的紫外-浓度标准曲线,通过涂板法、试剂盒法等证明TAP酞菁锌光敏剂具有良好的光动力抗菌效果,对大肠杆菌具有显著的抗菌活性,能够在有效作用浓度内高效杀伤细菌,且抗菌作用与光敏剂浓度呈正比。通过探针法解析TAP酞菁锌光敏剂对大肠杆菌的抗菌作用方式,证明TAP酞菁锌光敏剂可能是通过产生氢氧自由基型单线态氧发挥其抗菌作用。