FoxM1靶向肽9R-P49对L929成纤维细胞的抑制作用及机制

常 苗, 项 坤, 何佳萌, 梁安平, 花欣怡, 刘新荣, 江育虹, 茆灿泉

(西南交通大学生命科学与工程学院, 成都 610031)

叉头盒(Forkhead box, FOX)蛋白属于进化高度保守的转录因子超家族[1],在细胞稳态和发育过程中可调控多种转录途径并发挥生物学效应[2]。在FOX家族成员中,叉头盒M1 (Forkhead box M1, FoxM1)是一种重要的有丝分裂调控蛋白,在多种细胞(如上皮细胞、T细胞、B细胞和树突状细胞)的细胞周期调控中起到重要作用[3-4],如通过调控细胞周期蛋白D1(CCND1)、细胞周期蛋白B1(CCNB1)和Polo样激酶1(PLK1)参与S/G/M期转换;同时,FoxM1也能够通过上调BIRC5从而调控有丝分裂纺锤体功能及其抗凋亡活性[5]。FoxM1在肺纤维化、心脏纤维化和肝纤维化等纤维化疾病中存在潜在功能,在这些疾病中,FoxM1的表达显著增加,其下游通路及与多种纤维化效应因子相关的信号通路,如TGF-β1/Smad、PI3K/Akt、p38 MAPK或WNT/β-catenin均显著上调[6-7]。针对FoxM1的靶向调控,大多数研究均集中于大分子蛋白或非编码RNA等领域,靶向多肽的研究报道较少。

本课题组前期通过噬菌体展示技术筛选和获得能够靶向结合FoxM1的DNA结合区(FoxM1-DBD)的P201多肽并显示具有强的抗肿瘤活性[8-9]。鉴于FoxM1表达与纤维化的密切相关性,本研究基于P201的优化肽9R-P49,研究其对FoxM1的调控作用及其在成纤维细胞L929细胞中的作用机制,最后结合转录组数据,探究9R-P49在成纤维细胞中的生物学功能,为抗纤维化靶向FoxM1潜在多肽药物的研发提供重要基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

小鼠成纤维L929细胞由四川大学华西医院教育部移植工程与移植免疫重点实验室提供。

1.1.2 试剂与仪器

多肽9R-P49(上海强耀生物科技有限公司合成,纯度>98%);胎牛血清、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶(美国Gibco公司);Transwell小室(美国Corning公司);CCK-8细胞增殖检测试剂盒、AO/EB法细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术有限公司);Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司);BSA、TEMED及硝酸纤维素滤膜(北京索莱宝科技有限公司);FoxM1、GAPDH兔源单克隆抗体(英国Abcam公司);HRP标记的山羊抗兔lgG(武汉三鹰技术有限公司)。酶标仪(美国Biotek公司);光学显微镜、荧光倒置显微镜(日本Olympus公司);流式分析仪(美国Beckman公司)。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法检测多肽对L929细胞的抑制作用

复苏L929细胞,不同浓度的9R-P49多肽(20.0、30.0、40.0和60.0 μg/mL)加药处理,培养12、24、48 h后向每孔加入10 μL的CCK-8检测溶液,置于37 ℃孵育2 h,酶标仪在450 nm波长处检测每孔吸光值。细胞抑制率=(1-加药组OD450/对照组OD450)×100%,使用Grahpad Prism 9计算IC50。

1.2.2 AO/EB荧光双染检测细胞凋亡

状态良好的L929细胞按每孔2.0×105个细胞铺12孔板,37 ℃培养箱培养约12 h,不同浓度的9R-P49(0、30.0和60.0 μg/mL)处理L929细胞24 h。PBS洗3次,AO溶液和EB溶液按1∶1混合成工作液后加入,室温孵育5 min,于荧光倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.3 FITC/PI荧光双染检测细胞凋亡

培养L929细胞24 h后收集培养液,经不含EDTA的胰酶消化后,离心收集细胞。用预冷的PBS洗涤细胞2次,加入Binding Buffer重悬细胞。再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution,轻轻混匀后避光室温反应10 min。最后加入400 μL 1×Binding Buffer,混匀后置于冰上,用流式细胞仪检测。

1.2.4 细胞平板克隆检测细胞增殖

将L929细胞按每孔700个细胞数铺至6孔板,37 ℃孵育约24 h,不同浓度9R-P49(0、30.0和60.0 μg/mL)处理L929细胞后每隔3 d换液,共处理2周。到达作用时间后PBS洗3次,多聚甲醛固定,结晶紫染色,相机拍照,克隆数>50计作一个克隆。

1.2.5 Transwell实验检测细胞迁移

L929细胞培养24 h,弃培养液,PBS清洗去除残留培养液,胰酶消化获得细胞,用DMEM高糖培养基重悬细胞,计数。按1×104cell/well加入Transwell上室,体积200 μL,下室加入600 μL含10%胎牛血清的培养基,在37 ℃培养24 h。到达作用时间后,取出小室,PBS清洗,4%多聚甲醛固定,0.1%结晶紫染色,光学显微镜下观察并拍照。

1.2.6 P49与FoxM1-DBD的分子对接

从PDB数据库(http://www.rcsb.org/)中下载FoxM1-DBD三维结构(PDB ID为3G73);Pymol软件处理蛋白,删除DNA双链、删除水分子、给FoxM1-DBD加氢;将P49的序列在Discovery Studio 2016中使用Protein Building功能构建出配体分子;利用DS2016进行分子对接,PyMOL 2.3.0可视化分析结果。

1.2.7 Western Blot检测FoxM1蛋白表达

复苏L929细胞后传代至12孔板,37 ℃培养至细胞融合达70%～80%;不同浓度9R-P49(0、30.0和60.0 μg/mL)处理L929细胞24 h后用RAPI裂解液裂解细胞,提取细胞总蛋白。经BCA蛋白定量后,取20.0 μg蛋白,常规Western Blot测定。主要实验过程:10% SDS-PAGE电泳,经转膜、5%脱脂奶粉封闭,一抗孵育[FoxM1(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000)],二抗孵育后,用ECL曝光显影。

1.2.8 转录组测序分析

不同浓度9R-P49(0、30.0和60.0 μg/mL)处理L929细胞24 h。到达作用时间后,显微镜下观察细胞,确定生长状态良好(正常细胞融合度在80%左右),弃去培养基,向培养皿中加入DEPC-PBS,洗2次后弃尽DEPC-PBS,加入适量Trizol Reagent细胞裂解液,反复吸打直至形成清亮不黏稠的细胞裂解液,将裂解好的细胞转移至1.5 mL离心管(RNase free)中,送上海伯豪生物技术有限公司进行mRNA测序。

1.2.9 统计学处理

2 结果与分析

2.1 9R-P49多肽对L929细胞的抑制作用

CCK-8结果显示(图1),随着处理浓度的增加,细胞形态逐渐发生变化,细胞密度减小,皱缩程度增大,细胞碎片逐渐增多,活细胞数量明显减少。依次添加4个不同浓度梯度9R-P49多肽处理L929细胞,随着给药浓度的增大细胞抑制率逐渐变高,并在40.0～60.0 μg/mL时达到100%左右,趋于饱和;同时随着给药处理时间的延长,从12 h到24 h细胞抑制率呈现增高趋势,48 h后基本保持稳定。给药处理12、24和48 h的IC50依次为(33.59±1.28) μg/mL、(26.92±1.58) μg/mL、(24.85±2.02) μg/mL,12 h与24 h相比差异极显著(P<0.01),24 h与48 h相比差异显著(P<0.05)。

(a)9R-P49处理后L929细胞形态(×100);(b)9R-P49不同浓度和时间处理后的细胞抑制率。图1 CCK-8法检测9R-P49多肽对L929细胞的抑制作用 Figure 1 Inhibitory effect of 9R-P49 polypeptide in L929 cells detected by CCK-8 method

2.2 9R-P49多肽对L929细胞凋亡作用的影响

经AO/EB荧光双染细胞主要呈现3种形态,即正常细胞核呈现绿染且核结构正常、早期凋亡细胞核呈现新月状或颗粒状的黄-绿染并伴随核染色体片段化、晚期凋亡细胞和死细胞核呈现橙染并伴随着核染色体的固缩等。经9R-P49多肽处理L929细胞24 h后,对照组未见明显的凋亡信号,细胞为绿染;加药处理后细胞中部分被染成黄绿色和橙色,同时随着给药浓度的增加,细胞凋亡信号明显增强(图2)。进一步流式细胞结果显示(图3),随着给药浓度的增加,凋亡细胞逐渐增加,在3组处理中依次为1.23%、5.66%、29.72%,加药组与对照组差异均极显著(P<0.01)。

(a)AO/EB荧光双染;(b)细胞凋亡量化图。** 为P<0.01。图2 AO/EB双染检测9R-P49对L929细胞的凋亡作用 Figure 2 AO/EB double staining detection of the apoptosis in L929 cells treated by 9R-P49

(a)流式细胞分析;(b)细胞凋亡和坏死量化图。** 为P<0.01。图3 流式细胞术检测不同浓度9R-P49处理的L929细胞的凋亡作用Figure 3 Detection of L929 cells treated with different concentrations

2.3 9R-P49多肽对L929细胞增殖的作用

L929细胞平板克隆结果显示(图4),随着给药浓度的增加,细胞形成的克隆斑显著下降,当给药浓度为60.0 μg/mL时,已经无明显的克隆斑。

图4 细胞平板检测9R-P49对L929细胞的增殖抑制作用Figure 4 Inhibitory effect of 9R-P49 on the proliferation of L929 cells detected by cell plate assay

2.4 9R-P49多肽对L929细胞迁移的作用

Transwell结果显示,经9R-P49多肽处理L929细胞24 h后,对照组有大量细胞穿过小室且状态良好,给药组穿过细胞大量减少,当浓度为60.0 μg/mL时,基本无细胞迁移现象(图5)。

(a)Transwell细胞形态学结果;(b)细胞迁移量化图。** 为P<0.01。图5 Transwell小室检测9R-P49对L929细胞的迁移抑制作用 Figure 5 Inhibitory effect of 9R-P49 on the migration of L929 cells detected by transwell chamber

2.5 P49多肽与FoxM1-DBD的分子对接分析

用Discovery Studio 2016软件C-DOCKER半柔性对接预测P49多肽配体与FoxM1-DBD蛋白的相互作用。分子对接结果显示,P49多肽能够与FoxM1-DBD上的Arg 297、Ser 290和Asp 293位点形成氢键相互作用,这些位点位于FoxM1-DBD结合DNA的沟槽内,结合细胞水平实验结果推测P49多肽能够通过这些位点对FoxM1的表达起调控作用(图 6)。

图6 FoxM1-DBD与P49序列的分子对接Figure 6 Molecular docking between FoxM1-DBD and P49 sequence

2.6 9R-P49多肽对L929细胞FoxM1蛋白表达的影响

经9R-P49多肽处理L929细胞24 h后,Western Blot结果显示,FoxM1蛋白在L929细胞中有表达,分子质量约为84 ku(图7),与预期大小一致。用9R-P49多肽按30.0 μg/mL和60.0 μg/mL给药处理L929细胞后蛋白表达量呈现下降趋势,差异极显著(P<0.01)。

(a)Western Blot分析;(b)蛋白表达水平量化图。** 为P<0.01。图7 Western Blot检测9R-P49对FoxM1蛋白的抑制作用 Figure 7 Inhibitory effect of 9R-P49 on the expression of FoxM1

2.7 L929细胞给药处理的RNA转录组数据分析

筛选Pvalue<0.05,log2FC>1的基因作为差异表达基因。从火山图(图8)可以看出,当9R-P49多肽处理浓度为30.0 μg/mL时共得到419个差异基因,其中,170个基因表达上调,249个基因表达下调;给药浓度为60.0 μg/mL时共得到2 705个差异基因,其中,1 654个表达上调,1 051个表达下调,FoxM1转录水平下调1.49倍,与Western Blot结果一致;给药浓度30.0 μg/mL与60.0 μg/mL组相比存在1 431个差异表达基因,其中,1 026个表达上调,405个表达下调,包括与纤维化强相关的Col家族成员:Col1a2(下调)、Col8a1(下调)、Col3a1(下调)等,Fox家族成员:Foxl1(下调)、Foxn2(上调)、FoxM1(下调)等,TNF家族成员:TNFsf9(下调)、TNF(上调)、TNFsf15(上调)等。

GO分类下加药组在生物学过程途径中主要富集于结合、催化活性,细胞组分途径中主要富集于细胞、细胞器、细胞组分等,分子功能途径中差异基因数目最多,主要富集于细胞过程、单一组织过程、生物调节过程和新陈代谢过程等,且加药浓度的提高影响的整体生物学功能具有一致性(图9)。KEGG分类下加药组差异基因主要富集于免疫系统、内分泌系统、信号转导和新陈代谢等通路,暗示9R-P49主要参与这些信号通路的相关转导(图10)。

(a)30.0 μg/mL的9R-P49和对照组处理细胞;(b)60.0 μg/mL的9R-P49和对照组处理细胞;(c)60.0和30.0 μg/mL的9R-P49处理细胞。图9 用9R-P49多肽处理的L929细胞的转录组GO分析Figure 9 Transcriptome GO classification of L929 cells treated with 9R-P49 polypeptide

(a)30.0 μg/mL的9R-P49和对照组处理细胞;(b)60.0 μg/mL的9R-P49和对照组处理细胞;(c)60.0和30.0 μg/mL的9R-P49处理细胞。图10 用9R-P49多肽处理的L929细胞的转录组KEGG分析Figure 10 Transcriptome KEGG classification of L929 cells treated with 9R-P49 polypeptide

3 讨论与结论

纤维化是一种医学常见疾病,包括肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化和心脏纤维化等[10-11]。在纤维化过程中,组织微环境会发生剧烈的变化,其中包括细胞外基质分泌、细胞因子和趋化因子分泌等。大多疾病的发病和死亡都是由于纤维性增生损害身体重要器官功能所导致,而成纤维细胞的过度增殖是其主要的驱动因素之一。

FoxM1是一个比较经典的原癌基因,也是细胞增殖调控的关键因子。多项研究发现,FoxM1也是成纤维细胞激活及纤维化进展的关键驱动因子。Penke等[12]确定FoxM1是肺成纤维细胞激活的驱动因子,并强调其可作为肺纤维化治疗的潜在靶点。Balli等[13]通过谱系追踪研究发现,在体内辐射诱导的肺纤维化过程中,FoxM1能够加重肺部炎症并影响EMT过程中重要基因的表达,同时有研究表明FoxM1通过发挥转录因子作用调控心脏纤维化进程,并强调了靶向FoxM1治疗心脏纤维化的治疗潜力。

成纤维细胞的活化和增生是组织纤维化的重要特征,FoxM1的表达量与纤维化程度呈正相关性[12]。通过9R-P49给药处理后,FoxM1表达量显著下降;通过不同浓度的9R-P49处理L929细胞,发现9R-P49能够显著抑制细胞增殖、迁移并增强细胞凋亡能力,证实该多肽能够通过调控FoxM1的表达影响成纤维细胞的生物学功能。Gu等[14]研究证明二甲双胍作为一种有机合成物能够通过激活AMPK并下调FoxM1的表达,从而减轻肺纤维化小鼠模型的各项症状,证明FoxM1在肺纤维化途径中起到不可忽略的作用。推测9R-P49多肽类药物可能发挥比较类似的生物学功能。为此,我们进行了L929细胞9R-P49多肽给药处理的RNA转录组测序。给药细胞组在不同浓度均有大量差异基因,随着给药浓度的加大差异基因逐渐增多。与纤维化密切相关的基因家族包括MMP家族、TNF家族、TGF家族、FGF家族和Col家族。另外,还包括多个FOX家族相关基因的调控,如FoxM1、Foxl1、Foxn2、Foxg1和Foxs1等。Foxl1被证实与肺纤维化高表达相关[15]。同时还有一些其他FOX蛋白参与纤维化的进展,如FOXA、FOXC[16]和FOXO家族[17]等。从GO分类可以看出,参与调控的基因主要包括炎症因子、TGF和FGF等。研究证明炎症因子家族成员在组织纤维化过程中发挥重要作用[18-19]。KEGG分类主要影响免疫系统、内分泌系统、信号转导和新陈代谢等通路。

本研究初步确认了FoxM1-DBD靶向结合肽9R-P49能够通过下调FoxM1表达从而抑制L929细胞增殖和迁移并促进凋亡,最后通过转录组数据进行佐证。多肽类药物具有活性高、用量小、低免疫原性的特点被广泛应用,本研究为靶向FoxM1抗纤维化潜在多肽药物研发提供了重要工作基础。但9R-P49结合肽是否通过分子对接所预测的位点起到调控作用仍值得进一步研究。更值得关注的是,FoxM1作为原癌基因在多种肿瘤细胞起重要作用,9R-P49在调控纤维化途径中具体涉及的信号转导途径及其与肿瘤之间的关系仍需要进一步深入探究。