基于线粒体16S rRNA基因序列探讨中气门亚目的系统发育关系

杨慧娟, 陈 婷, 董文鸽

(大理大学病原与媒介生物研究所云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室, 大理 671000)

中气门亚目(Mesostigmata)在动物学分类上隶属于节肢动物门(Arthropoda)、蛛形纲(Arachnida)、蜱螨亚纲(Acari)、寄螨总目(Parasitiformes)[1],是寄螨总目中生物多样性最为丰富的类群,其分布十分广泛、种类繁多,有着极其多样化的生活方式和栖息地,由捕食螨、有益螨和寄生螨组成[2-3]。中气门亚目共包括25个总科,109个科,878个属,约11 424种[4],它们是森林土壤生态系统分解过程的重要调节者,在土壤分解食物网中占据一个高营养级[5]。许多中气门亚目物种是线虫、其他螨类、弹尾虫以及小型昆虫幼虫的捕食者;大多数物种喜欢富含有机质、土壤水分高、土壤温度中等、pH值低的生境[6-7]。因此,这些中气门亚目物种的存在/不存在可以反映土壤中微生物区系(真菌和细菌)、微型动物(线虫)、中型动物(其他蠕虫和弹尾目动物)以及有机质的理化条件[8]。也有许多中气门亚目物种与人类生活和农牧业的生产发展密切相关,具有重要的医学和社会经济意义[9]。如耶氏厉螨(Laelapsjettmari)和格氏血厉螨(Haemolaelapsglasgowi)自然携带肾综合征出血热病毒(haemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS);狄斯瓦螨(Varroadestructor)可对全世界养蜂业造成主要威胁;甜菜寄螨(Parasitusbeta)可以降低烟草幼苗的产量;甲虫寄螨(Parasituscoleoptratorum)常捕食家蝇幼虫;剑毛帕厉螨(Stratiolaelapsscimitus)是一种重要的捕食性螨,主要用于防治食用菌和温室害虫[10-14]。

线粒体基因组具有结构简单,母系遗传,拷贝数量多、进化速度快且不同基因进化速率不同等特点,已被广泛用于生物地理学、分子进化模式、系统发生学和种群遗传学等研究[15]。近年来,随着DNA条形码技术的快速发展,越来越多的DNA条形码被广泛应用于物种的鉴定、分子系统的分类及系统发育关系的研究。线粒体16S rRNA基因具有适中的进化速率,常被用于物种的系统进化和分类研究[16]。目前,大部分研究集中在昆虫和哺乳动物线粒体16S rRNA基因的进化研究,少有研究利用单个线粒体基因分析螨类不同阶元在分子水平上的差异及科属种间的亲缘关系。本研究通过测定粪堆寄螨(Parasitusfimetorum)的线粒体基因组全序列,并结合NCBI数据库中已有的中气门亚目22个物种的线粒体16S rRNA基因全序列,对中气门亚目23种革螨的线粒体16S rRNA基因全序列进行比较分析及系统发育研究。目的是基于线粒体16S rRNA基因全序列探讨中气门亚目物种的系统发育关系,为后续研究中气门亚目物种的系统发育关系提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

从云南省丽江市捕获的齐氏姬鼠(Apodemuschevrieri)体表采集粪堆寄螨(Parasitusfimetorum)(登录号为NC061975),捕获的齐氏姬鼠按照“一鼠一袋”原则进行体表寄生螨的采集,“全捕法”采集体表寄生螨,按照“一鼠一瓶”原则将采集的螨虫标本置于盛有95%乙醇的EP小管中,放置于-80 ℃超低温冰箱保存以备用,粪堆寄螨及其宿主齐氏姬鼠标本均保存在大理大学病原与媒介生物研究所。所有用于捕捉齐氏姬鼠的方法和程序都经过大理大学动物伦理委员会的审查和批准,批准号为MECDU-201806-11。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR扩增和序列测定

用DNeasy血液和组织试剂盒(QIAGEN)提取基因组DNA。使用节肢动物中高度保守的引物对12SF(TACTATGTTACGACTTAT)和12SR(AAACTAGGATTAGATACCC)通过聚合酶链反应(PCR)初步扩增12S rRNA基因的短片段。将获得的扩增产物送至赛默飞世尔科技公司(广州)使用Sanger法测序,以获得12S rRNA基因的部分序列。再根据获得的12S rRNA基因短片段的保守序列进一步设计粪堆寄螨的特异引物m12SF(GCGTTGTATCCTTTATAGGGCAAATTCCTC)和m12SR(CAGTTAAGTACGTTAGGTCAAGGTGCAGC),用特异引物进行PCR,产生约15 kb的扩增子片段。Takara ExTaq酶用于短片段扩增,PCR反应条件:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性1 min,48 ℃～65 ℃退火1 min,54 ℃延伸1 min,共37个循环;72 ℃终止延伸10 min。Takara LATaq酶用于长片段扩增,反应条件:96 ℃预变性1 min;96 ℃变性10 s,56 ℃～60 ℃退火40 s,58 ℃～68 ℃延伸9 min,共40个循环;68 ℃终止延伸15 min。在实验过程中,同时进行阳性和阴性对照实验以确保实验结果准确性。使用琼脂糖凝胶(1%)进行电泳,通过与Markers值比较估计PCR扩增子的大小。PCR产物使用Wizard SV Gel and PCRclean-up system(Promega)试剂盒纯化后送往美吉生物公司通过Illumina Miseq PE250 platform进行高通量测序。

1.2.2 序列组装和基因识别

用Geneious Prime 2021.0.1[17]软件将测序结果按照参数:Minimum overlap 50 bp, Minimum Overlap Identity 98% 进行组装,以获得粪堆寄螨线粒体基因组全序列。组装完成的数据在NCBI数据库进行BLAST比对识别蛋白编码基因,通过ARWEN[18]和tRNAscan-SE[19]查找识别tRNA基因,ARWEN采用默认设置,而tRNAscan-SE设置如下:Search Mode=EufindtRNA-Cove, Source=Nematode Mito, Genetic Code=Invertebrate Mito, Cove score cutoff=0.1,rRNA基因根据基因间的相对位置进行比对识别。

1.3 序列分析

利用Geneious Prime 2021.0.1软件抽提粪堆寄螨线粒体16S rRNA基因全序列,从NCBI数据库下载中气门亚目10科17属22种(代表中气门亚目已测序的多数类群)的线粒体16S rRNA基因全序列(表1),并对中气门亚目23种革螨的线粒体16S rRNA基因全序列进行比较分析及系统发育研究。为进一步提高测序结果的准确性,在NCBI数据库对16S rRNA基因全序列进行BLAST比对。用MEGA X[20]软件计算线粒体16S rRNA基因的碱基含量、遗传距离、保守位点(Conserved sites)、变异位点(Variable sites)及简约信息位点(Parsimony informa-tive sites)。运用Clustal X 2.0[21]进行序列比对。使用DAMBE[22]软件进行碱基替换饱和性分析。选择美洲鲎(Limuluspolyphemus)(JX983598)和圆尾鲎(Carcinoscorpiusrotundicauda)(MW446894)作为外群,利用MEGA X软件使用最大似然法(Maximum likelihood,ML)构建ML树。使用Partition Finder[23]软件基于Bayesian Information Criterion(BIC)选择贝叶斯树最佳核苷酸替代模型为TVM+I+G。根据获得的最佳核苷酸替代模型利用贝叶斯3.2.7[24]软件使用贝叶斯推断法(Bayesian inference,BI)构建BI树。用自展检验(bootstrap test)评估所构建ML树的可靠性,重复1 000次以评估各分支的置信值;采用马尔科夫链蒙特卡洛(Markov Chain Monte Carlo, MCMC)方法构建BI树,共运行100万代,每1 000代抽样一次,并舍去前25%的老化样本。

表1 中气门亚目物种信息Table 1 Information on the species of Mesostigmata

2 结果与分析

2.1 序列分析

本研究所测序的粪堆寄螨属于寄螨科,线粒体基因组全序列已提交至GenBank(登录号为NC061975),其线粒体16S rRNA基因全长为1 194 bp,比大部分中气门亚目物种的线粒体16S rRNA基因长。4种碱基组成分别为37.2% A、38.3% T、8.6% G 、15.9% C。中气门亚目用于分析的23种革螨的线粒体16S rRNA基因长度在1 044～1 210 bp(表1),序列总体长度差异不大。对中气门亚目23种革螨的线粒体16S rRNA基因序列进行比对和修剪后,最终得到1 020 bp的串联序列用于比较分析,发现未存在大的缺失和插入。共有256个保守位点,762个变异位点,666个简约信息位点,95个单一信息位点。物种间碱基组成略有差异:A(31.8%～45.8%)、T(35.7%～46.9%)、G(4.8%～13.2%)和C(4.7%～19.1%)。大部分物种的AT偏斜和GC偏斜为负值,表明中气门亚目大部分物种线粒体16S rRNA基因更偏好使用T和C碱基。序列碱基转换数(636)远大于颠换数(85),且转换与颠换比值R为7.51。

2.2 遗传距离与替换饱和分析

利用Kimura双参数法计算中气门亚目物种间线粒体16S rRNA基因的遗传距离(表2),计算结果显示,中气门亚目23种革螨的遗传距离在0.111～0.359,平均遗传距离为0.291。寄螨科的粪堆寄螨(Parasitusfimetorum)与王氏寄螨(Parasituswandunqingi)的遗传距离最小(0.111);双雌螨科的Quadristernosetac.f.intermedia与厉螨科的剑毛帕厉螨(Stratiolaelapsscimitus)的遗传距离最大(0.359)。使用DAMBE软件分析中气门亚目23种革螨线粒体16S rRNA基因的碱基替换饱和性,以遗传距离为横坐标,转换与颠换比值为纵坐标构建碱基替换饱和分析散点图,以检测线粒体16S rRNA基因的系统发育信号(图1)。可以看出,遗传距离和转换与颠换比值呈明显的线性关系。表明中气门亚目23种革螨线粒体16S rRNA基因的碱基替换未达到饱和,可以利用线粒体16S rRNA基因分析中气门亚目23种革螨的系统发育关系。

图1 碱基替换饱和性分析Figure 1 Base substitution saturation analysis

表2 中气门亚目23个物种线粒体16S rRNA基因的遗传距离Table 2 Genetic distance of mitochondrial 16S rRNA genes in 23 species of Mesostigmata

2.3 系统发育分析

以美洲鲎(Limuluspolyphemus)和圆尾鲎 (Carcinoscorpiusrotundicauda) 为外群,利用最大似然法(ML)和贝叶斯推断法(BI)构建系统发育树(图2和图3)。两种方法构建的系统发育树形成的拓扑结构略有区别,但系统发育树的每个节点支持率都较高。中气门亚目23种革螨根据遗传距离及亲缘性将系统发育树分成两个部分,双雌螨科的3个物种单独构成一个进化分支,位于系统发育树的基部。其余9科15属20种共同构成系统发育树的第二大分支。在ML树和BI树中,本研究的粪堆寄螨(Parasitusfimetorum)均与王氏寄螨(Parasituswandunqingi)聚在一起,再与土革螨科的物种(Stylochyrusrarior)形成姐妹分支,表明在中气门亚目中,寄螨科与土革螨科的亲缘关系更近。各科间的系统发育关系都很清晰,除了剑毛帕厉螨(Stratiolaelapsscimitus)的系统发育地位在两种系统发育树中存在分歧,ML和BI树均显示它与狄斯瓦螨(Varroadestructor)的亲缘关系最近(图2和图3)。

节点上的数字表示bootstrap值。图2 基于线粒体16S rRNA基因构建的最大似然树Figure 2 Maximum likelihood tree constructed based on mitochondrial 16S rRNA gene sequences

节点上的数字表示后验概率。图3 基于线粒体16S rRNA基因构建的贝叶斯系统发育树Figure 3 Bayesian phylogenetic tree constructed based on mitochondrial 16S rRNA gene sequences

3 讨论与结论

本文分析中气门亚目10科17属23种革螨的线粒体16S rRNA基因序列信息及系统发育关系。结果发现中气门亚目物种AT含量远高于GC含量,呈明显的AT偏好性。通常鸟类、哺乳类等高等动物线粒体基因组的GC含量高于AT含量,而无脊椎动物等低等动物线粒体基因组的AT含量高于GC含量[25]。4种碱基(A、T、G、C)不对称的突变和选择压力会导致碱基组成的偏好性,一般来自基因的复制和转录[26]。复制起始点的方向与GC含量相关,而复制起始点方向的改变、基因方向以及密码子位置的改变随AT含量的变化而变化[27]。因此,线粒体基因组中碱基组成的偏好性对研究线粒体基因组的复制和转录有重要意义。

物种的进化反映在基因的变异,动物线粒体基因组的进化主要与碱基转换和颠换有关,且转换发生的频率高于颠换[28]。常用碱基转换与颠换比值R估算序列饱和度,若R>2,则表示基因序列未达到突变饱和;若R<2,则表示基因序列已达到突变饱和,受进化噪音影响的可能性较大,构建系统进化树时若不进行加权就会导致构建错误的进化树[29]。物种之间的分歧时间越短、亲缘关系越近,其转换与颠换比值也就越大。中气门亚目物种线粒体16S rRNA基因序列的转换与颠换比值为7.51,远大于2,表明中气门亚目23种革螨线粒体16S rRNA基因序列未达到饱和,具有较强的进化潜力,并随时间推移和环境等因素的改变响应的适应性进化能力越强。

遗传距离通常反映物种丰富的遗传多样性或变异性,遗传距离越大,表明亲缘关系越远,遗传多样性或变异性就越高;相反,遗传距离越小,表明亲缘关系越近,遗传多样性或变异性就越低[30]。根据遗传距离结果显示,Quadristernosetac.f.intermedia与剑毛帕厉螨(Stratiolaelapsscimitus)之间亲缘关系最远(0.359);粪堆寄螨与王氏寄螨(Parasituswandunqingi)之间亲缘关系最近(0.111),科内物种间的遗传距离范围明显小于它们与不同科间物种的遗传距离范围,表明线粒体16S rRNA基因序列的遗传距离可用于界定物种及其所在高阶分类单元的地位。

系统发育树作为研究种群关系的方法之一,在后生动物线粒体基因组中得到了广泛应用[31]。多年来,中气门亚目不同分类群之间的系统发育关系一直存在争议,特别是高阶分类群间的系统发育关系没有得到解决[32]。Klompen等[33]利用核糖体18S rDNA和28S rDNA基因在股(cohort)水平上对寄螨总目进行系统发育分析,显示革螨股(Gamasina)是单系群。Li等[34]利用13个蛋白编码基因和2个rRNA基因对中气门亚目部分物种进行系统发育分析,显示中气门亚目是单系群。本文基于线粒体16S rRNA基因序列构建了中气门亚目23种革螨的系统发育树,ML和BI树均显示中气门亚目是单系群,且每个节点支持率都很高,说明中气门亚目各科间的亲缘关系较近,这与Li等[34]的结果相同,进一步表明线粒体16S rRNA基因用于构建中气门亚目物种的系统发育关系具有稳定、可靠的特点。双雌螨科位于ML树和BI树的基部,说明双雌螨科是中气门亚目中较早分化的类群。本研究测序的粪堆寄螨隶属于寄螨科,在传统的形态学分类上,寄螨科被认为与囊螨科和植绥螨科的亲缘关系较近[35],本文及文献[34]构建的系统发育树显示,寄螨科与土革螨科形成了姐妹群,与传统分类存在差异,表明分子分类与传统的形态学分类不完全一致。剑毛帕厉螨(Stratiolaelapsscimitus)的系统发育位置在ML和BI树中存在分歧,但都显示与狄斯瓦螨(Varroadestructor)有着较近的亲缘关系。除厉螨科外,大部分同科或同属的物种总是以较高的置信度优先聚在一起,有些科仅有一个物种代表,但都与其亲缘关系较近的科一起构成姐妹群。

通过分析中气门亚目10科17属23种革螨的线粒体16S rRNA基因序列,发现中气门亚目物种线粒体16S rRNA基因仍存在较强的进化潜能,遗传距离及系统发育分析为后续研究中气门亚目物种的系统发育关系提供依据。由于部分类群的分子分类与传统的形态学分类不完全一致,后续应对中气门亚目更多物种的形态及分子等方面进行更深入全面的研究。