不同消毒剂对藜麦种子表面消毒效果和萌发影响综合评价

朱丽丽, 张业猛, 李万才, 赵亚利, 陈志国

(1. 中国科学院西北高原生物研究所, 西宁 810008; 2. 中国科学院大学, 北京 100049; 3. 中国科学院高原生物适应与进化重点实验室, 西宁 810008; 4. 青海省作物分子育种重点实验室, 西宁 810008; 5. 互助县种子站, 海东 810500; 6. 乐都区种子站, 海东 810700)

藜麦(ChenopodiumquinoaWilld.)是苋科藜属一年生双子叶植物,种子富含蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质和膳食纤维等,低脂、低糖及零胆固醇,被联合国粮食及农业组织(FAO)认定为可满足人体基本营养需求的唯一一种单体植物,推荐为适宜人类的完美全营养食品,在食品领域具有广阔的发展前景[1]。目前,全球气候持续变暖、极端天气事件发生频率和强度增加,加重了粮食不安全性,而藜麦具有耐寒、耐旱、耐盐碱和耐瘠薄等生物学特性,因此,成为未来最具潜力的作物之一[2-3]。

在种子萌发实验中,必须先对种子表面进行消毒处理,否则种子在实验过程中发霉,对实验结果造成严重的影响。种子萌发期是植物生长过程中对外界环境最敏感的时期,代磊等[4]研究了消毒剂种类、浓度及处理方式对白及种子发芽率的影响,发现消毒剂种类是影响消毒效果的重要因素;郭丽等[5]对野生薄皮木种子消毒处理发现,HgCl2的污染率远远低于NaClO和H2O2;刘昊等[6]研究表明,同一浓度和处理时间下的几种消毒剂中,NaClO对番茄种子具有较好的消毒效果;田金丽等[7]在籽用南瓜种子的消毒处理中发现,H2O2有一定的抑菌效果但不明显;晏家祥等[8]利用包括KMnO4和NaClO在内的5种消毒剂对毛红椿种子进行消毒发现,NaClO对幼苗的生长有一定的抑制作用,KMnO4能够促进种子发芽,因此,不同消毒剂对不同作物适用的效果不一致。对藜麦种子发芽试验表面消毒方法还未见文献报道。研究表明,藜麦种子萌发期和苗期对药剂极其敏感,选择适宜藜麦的种子表面消毒剂和剂量,开展藜麦种子消毒方法研究,对建立藜麦种子检验相关标准,对藜麦育种和良种繁育至关重要[9]。因此,需要开展藜麦萌发特性研究。截至目前,虽然在藜麦萌发研究中涉及实验前种子表面消毒[9-15],但采用的消毒方法各异,且仍然存在种子发霉现象。这与采用的消毒剂和消毒方法达不到好效果有很大关系,因此,本实验采用几种常用的消毒剂,利用两个藜麦品种进行消毒处理,旨在找出针对藜麦籽粒表面消毒效果最佳的方法。

1 材料与方法

1.1 材料和设计

以青藜11号和青藜12号(均为本实验室新认定品种)籽粒为实验材料,采用高锰酸钾(KMnO4)、过氧化氢(H2O2)、次氯酸钠(NaClO)、氯化汞(HgCl2)和75%乙醇等5种常用种子消毒剂,分别设置0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%和3%等7个浓度梯度,每个浓度分别设置1、5、10、15、20、25和30 min等7个时间梯度;其中75%乙醇仅进行7个时间梯度处理,以蒸馏水冲洗为对照,正交表为L49(41×72),见表1。

表1 正交试验设计表Table 1 Orthogonal experimental design table

参试品种为2021年收获的新种子。人工挑选籽粒饱满、大小均匀、无病虫害、无机械损伤的种子,根据表1设计分别处理后,用蒸馏水反复冲洗5次,再放入消毒过的发芽盒。每个发芽盒铺放两张发芽纸,倒入10 mL的蒸馏水将发芽纸浸湿,每个发芽盒放置150粒种子,3次重复。标记好发芽盒后,放入恒温培养箱。培养箱条件设置:光照25 ℃ 16 h/黑暗20 ℃ 8 h,湿度为70%。24 h后开始第一次观测,记录种子萌发情况,发芽期间每天定时观测,进行发芽数、发霉种子数、不正常发芽数和畸形种子数统计,同时给发芽盒适量补充蒸馏水,以保证发芽床湿润,及时将发霉的种子除去。实验共7 d,第8天每个处理随机选择10株,进行幼苗早期生长指标测量。

1.2 方法

(1)种子萌发指标测定。发芽开始后每天进行发芽数、发霉种子数、不正常发芽数和破裂(畸形)种子数的调查,计算发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数。由于藜麦极易发芽,为统一发芽标准,以胚芽长短大于2 mm作为发芽指标[9]。

发芽率GR=第7天发芽种子数/供试种子总数×100%

发芽势GE=第3天发芽种子数/供试种子总数×100%

发芽指数GI=∑(Gt/Dt)

活力指数VI=S×GI

胚破裂率ERR=第8天破裂种子数/供试种子总数×100%

异常发芽率WGR=第8天不正常部位发芽数/供试种子总数×100%

发霉率MR=霉变种子总数/供试种子总数×100%

其中,S:第7天正常幼苗平均鲜重;Gt:在第t天的发芽个数;Dt:发芽的天数。

(2)早期幼苗生长指标的测量。7 d后萌发结束,从每个处理中随机选取10株幼苗,用直尺测量幼苗长度,用电子分析天平称量幼苗鲜重,计算根长、芽长和鲜重。根长(RL):根和芽接点处到最长根尖的长度;芽长(BL):子叶与根之间的长度;鲜重(FW):种子的胚根和胚芽以及幼叶部分的重量,不包括种子生根发芽后脱落的种皮部分。

(3)为避免藜麦种子间的差异对结果产生影响,进行综合评价时均采用各指标的相对值[16-17]。

相对性状指标=不同处理下各性状测定值/对照各性状测定值

1.3 各指标隶属函数值

隶属函数评估法是根据模糊数学的原理,利用隶属函数进行综合评估,在多指标测定基础上对植株特性进行综合性评价,本文参考文献[18-21]的方法。

1.4 数据分析方法

采用Excel 2003进行数据处理和隶属函数值计算,SPSS 23.0软件进行主成分分析和相关性分析,运用OriginPro 9.1绘制柱形图,并使用R语言绘制相关性热图。

2 结果与分析

2.1 不同处理下各萌发指标和早期幼苗生长指标的变化

由图1可知,HgCl2处理中,除43号(0.1% 5 min)以外,两个藜麦品种籽粒的各萌发指标和早期幼苗生长指标与对照相比都明显偏低,说明HgCl2对藜麦籽粒有较强的抑制(毒害)作用,对种子萌发不利。在浓度较小、处理时间较短时,则不会对种子造成太大的危害;其他4种消毒剂处理下的各项指标与对照无太大差异。在3项早期幼苗生长指标中,两个藜麦品种籽粒的芽长在各处理间的变化不大,而根长和鲜重变化较大,说明不同消毒处理易对藜麦幼苗根的生长产生抑制作用,后期鲜重的差异可能也是由于根的差异造成的,这是因为藜麦在萌发时胚根先于胚芽生长外露,而胚芽(子叶)被种皮包裹,对其产生的毒害作用相对胚根较小。在不同处理下,同一指标在两个藜麦品种间也有一定差异,这可能是品种间的基因型差异造成的。

1～12为KMnO4;13～24为H2O2;25～37为NaClO;38～49为HgCl2;50～56为75%乙醇;59为对照。图1 不同处理藜麦种子萌发指标和早期幼苗生长指标Figure 1 Differences of germination indicators and early seedling growth indicators under different treatments

2.2 不同处理下各负向指标及消毒效果的变化

实验表明,各种消毒剂处理还会导致胚的破裂和异常萌发(不正常部位萌发、子叶过早长出且胚根较短),见图2、图3。NaClO、HgCl2和75%乙醇处理比KMnO4和H2O2更易导致藜麦种子破裂,特别在处理时间较长时,说明在对藜麦种子进行表面消毒时不可浸泡太长时间。异常发芽率除HgCl2外,在其他消毒剂间的差异并不大,说明HgCl2极易导致藜麦种子萌发异常。这可能是因为较强毒性和过长时间的浸泡破坏了种子的发芽孔,并使得种皮变软,从而导致种皮极易破裂,子叶过早从破裂部位长出,胚根生长受到抑制或从其他部位突破种皮。两个藜麦品种的发霉率除17号(1% H2O210 min)和24号(1% H2O25 min)外,其他处理均比对照低,说明1% H2O2对藜麦种子消毒效果不理想。两个藜麦品种在各处理下的发霉率虽有一定的差异,但总体消毒效果基本一致,说明消毒效果依品种而有微小变化。

(a)异常发芽前期;(b)正常发芽前期;(c)异常发芽后期;(d)正常发芽后期;(e)破裂的种子。图3 正常发芽与异常发芽前后期对比Figure 3 Comparison of normal germination and abnormal germination before and after

2.3 各指标间相关性

由图4可知,发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、根长、芽长和鲜重之间互相呈极显著正相关,胚破裂率和异常发芽率与以上7项指标虽然在青藜11号品种中相关不显著,但在青藜12号中呈极显著负相关,可能是品种间的差异造成的。在两个品种中,发霉率与其他指标都不相关,可能是因为本实验所选的两个品种种子活力较强,且各处理都达到了较明显的消毒效果,发霉率显著降低,没有明显影响到藜麦种子的萌发和幼苗生长。

(a)青藜11号;(b)青藜12号。图片和数字颜色均与相关性一致,蓝色代表正相关,红色代表负相关,白色代表不相关;* 为P<0.05,表示显著性相关;** 为P<0.01,表示极显著性相关。ERR: 胚破裂率;WGR: 异常发芽率;MR: 发霉率;RL: 根长;BL: 芽长;GR: 发芽率;GE: 发芽势;GI: 发芽指数:VI: 活力指数;FW: 鲜重。图4 青藜11号和青藜12号各指标间相关性Figure 4 Correlation between indicators of Qingli No.11 and Qingli No.12

2.4 各指标描述性统计

由表2可知,两个藜麦品种籽粒的调查性状差异明显。在57个消毒处理下,青藜12号的发芽率较青藜11号高,说明青藜12号比青藜11号更耐胁迫。此外,10个指标的变异系数均较高,说明不同种类的消毒剂在不同浓度与处理时间下对藜麦籽粒萌发和消毒效果具有明显的影响。

表2 各指标描述性统计Table 2 Descriptive statistics of each index

2.5 各指标因子分析

在主成分因子分析前,采用SPSS对原始数据进行KMO检验和Bartlett检验,结果如表3所示。两个藜麦品种的KMO检验值均大于0.5,适合进行因子分析,Bartlett检验结果为P<0.05,说明实验数据符合正态分布。因此,本研究实验数据适合做因子分析。

表3 KMO和Bartlett适合性检验Table 3 KMO and Bartlett fitness test

通过主成分分析(表4),两个藜麦品种籽粒的前2个主成分特征值均大于1,累计贡献率分别为80.87%和81.375%,能够反映10个指标的大部分信息,因此提取前2个主成分作为评价指标。在2个新提取的综合指标中,青藜11号和青藜12号两个品种的相对发芽率、相对发芽势、相对发芽指数、相对活力指数、相对根长、相对芽长和相对鲜重在主成分1中的特征值较大,影响程度较高,说明主成分1主要反映了不同消毒处理下藜麦种子的萌发指标,因此,这7个指标可以作为籽粒萌发筛选的依据;而相对胚破裂率和相对异常发芽率在主成分2中的特征值较大,可作为负向筛选因子。

表4 各指标主成分分析Table 4 Principal component analysis of each index

2.6 不同处理综合评价

采用隶属函数法计算出各指标的隶属函数值,根据公式计算出不同处理的综合评价D值并进行排序。结果如表5所示,使用HgCl2对两个藜麦品种籽粒进行消毒处理(38～49)排名都比较靠后,消毒效果不理想,说明HgCl2毒性太强,即便浓度较低、处理时间短,也仍然对藜麦种子萌发具有较强的抑制作用,不宜使用。其余3种消毒剂中,KMnO4的消毒效果比H2O2和NaClO好。根据综合评价D值,6号、9号、12号、29号和36号处理在两个藜麦品种中的排名都比较靠前,说明这5个消毒处理条件下的藜麦籽粒萌发及消毒效果较好,并且对藜麦种子破坏较小。

表5 综合评价D值和排名Table 5 D value and ranking of comprehensive evaluation

通过对D值与各指标的相对值进行相关分析(表6),可以看出相对发芽率、相对发芽势、相对发芽指数、相对活力指数、相对根长、相对芽长和相对鲜重等7个萌发指标与综合评价D值呈极显著相关,且相关系数较高,说明这些指标能够用来有效评价消毒处理对藜麦籽粒萌发的影响。相对胚破裂率和相对异常萌发率与D值呈极显著负相关,说明在评价消毒效果时,考虑不同处理是否造成胚破裂与异常部位的萌发也极其重要。相对发霉率与D值没有达到显著相关,可能是因为本研究的两个藜麦品种籽粒在对照条件下发霉率也较低。

表6 综合评价D值与各指标的相关性Table 6 Correlation of the comprehensive evaluation D value and various indicators

3 结论

本研究利用隶属函数法对不同消毒剂处理下的藜麦种子萌发指标、幼苗生长指标及消毒效果进行综合评价发现,使用KMnO4处理(2.5% 15 min、0.5% 5 min、2% 1 min)和NaClO处理(0.1% 15 min、0.1% 10 min)对两个藜麦品种籽粒的整体效果较使用H2O2和HgCl2效果好,考虑安全性和便利性,使用2.5% KMnO4处理15min效果最佳。