常压室温等离子体技术在微生物诱变育种中的研究进展

陆 欢, 沈 玲,2, 尚晓冬, 刘建雨, 王瑞娟, 杨 慧

(1. 上海市农业科学院食用菌研究所农业农村部南方食用菌资源利用重点实验室国家食用菌工程技术研究中心上海市农业遗传育种重点实验室, 上海 201403; 2. 上海海洋大学食品学院, 上海 201306)

生物育种技术作为生物经济的重要组成方面,不仅具有较高的研究价值,还有广阔的应用前景。诱变育种是微生物育种的主要方法之一,其中,化学诱变和物理诱变在菌株选育和改造中起着重要作用,化学诱变剂主要造成DNA烷基化损伤或者形成碱基加合物,物理诱变对DNA的损伤主要是形成环丁烷嘧啶二聚体和6-4光产物以及它们的杜瓦共价异构体,但存在可操作性差、安全性风险高、突变效率不可控等缺点[1]。常压室温等离子体(Atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变技术作为近年发展起来的一种新型诱变技术,具有操作灵活、设备简单、条件温和、安全性高、突变型多样性、诱变速度快等优点,能较好解决传统技术所困扰的问题,尤其是ARTP诱变条件可控,可有效提高突变强度和突变库容量,在微生物育种中发挥重大作用。

ARTP是一种基于氦射频大气压辉光放电等离子体的全细胞诱变工具,能有效造成DNA多样性损伤,进而提高突变率,且不会产生有毒有害物质,比传统的紫外线辐射或化学诱变剂具有更大的优势[2]。目前,ARTP诱变技术已广泛应用于细菌、真菌、放线菌和微藻等微生物育种工作中,但在食用菌育种方面的报道还较少。食用菌产业目前是仅次于粮、油、果、菜的中国第五大农作物产业,食用菌不仅含有丰富的营养成分,还富含多种功能活性物质,具有极高的营养价值和保健作用。因此,为满足消费者对营养均衡的需要,以及对食用菌品质的不断需求,亟需综合先进的育种技术,创制选育出优质、营养、符合市场需求的食用菌新品种。

目前,国内外对利用ARTP诱变技术筛选符合选育目标菌株开展了广泛研究,本文主要阐述ARTP诱变技术的概念、诱变机理、影响因素,并重点介绍ARTP诱变技术在微生物和食用菌育种研究中的应用,讨论ARTP诱变技术在微生物和食用菌育种研究中具有的优势以及面临的挑战,旨在通过新技术的建立和应用,为食用菌和微生物育种研究提供新的思路,进而推动微生物和食用菌的种质创新技术及产业可持续发展。

1 ARTP诱变育种概述

1.1 ARTP介绍

等离子体是一种电离气体,被称为物质的第四态。等离子体有3种分类方法:一是根据等离子体的存在形式分为天然等离子体和人工等离子体;二是根据其粒子的温度不同分为高温等离子体和低温等离子体,低温等离子体又可以分为热等离子体和冷等离子体;三是根据离子体的电子平均动能分为理想等离子体和非理想等离子体。诱变育种则是一种利用物理或化学诱变对微生物的群体细胞进行处理,通过提高突变率筛选出目标菌株的育种方法,从而克服传统诱变技术变异率较低、遗传不稳定等问题(表1)。

表1 ARTP诱变技术与其他诱变技术在育种中的优劣势对比Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of ARTP mutagenesis technology and other mutagenesis technologies in breeding

利用不同电极结构的等离子体发生器和不同频率的电源,可以驱动产生大气压非平衡等离子体。气体放电产生等离子体有介质阻挡放电、电晕放电、电弧放电和辉光放电等常见方式[3]。微生物利用等离子体诱变育种主要是利用大气压介质阻挡放电(Atmospheric pressure dielectric barrier discharge,APDBD)和大气压射频辉光放电(Radio-frequency atmospheric pressure glow discharge,RF APGD)产生大气压非平衡等离子体。APDBD等离子体由于存在介质层,难以获得均匀、稳定的放电,导致可控性较低,不利于产生高效的生物突变。RF APGD等离子体可在常温常压下发出高浓度活性粒子的等离子体射流,具有温度可控、放电均匀性高、操作条件安全温和、设备简单等特点,适用于微生物诱变育种[4]。邢新会利用大气压射频辉光放电原理,以RF APGD等离子体发生器为核心,开发了第三代突变育种设备——ARTP诱变仪,快速推动了微生物诱变育种的进程,各学者将ARTP诱变与其他诱变方法广泛应用于微生物育种[5]。此外,ARTP诱变还与高通量筛选相结合作为构建基因组改组文库的工具[6]。

1.2 ARTP诱变育种机理

在大气压条件下,常压室温等离子体能产生温度为25 ℃～40 ℃、具有高浓度活性粒子的等离子体射流。射流中的电子和自由基等能直接对细胞壁造成损伤,改变细胞膜的通透性,促进各种诱变剂进入细胞,作用于DNA以达到突变的目的。活性氧自由基通过细胞膜进入细胞后,首先与DNA分子中的碱基或脱氧核糖发生反应产生其他自由基,此时细胞DNA分子中高密度长片段受到损害,DNA复制受到阻碍,从而激发细胞的SOS修复机制。此外,一些低特异性的聚合酶、重组酶等是在DNA分子复制受到抑制时产生的,这些酶又可催化损伤部位DNA发生复制,使细胞得以存活,导致DNA复制过程中发生碱基错配、DNA链断裂,甚至导致染色体结构异常,使遗传性质发生翻天覆地的变化,进而引起广泛又长时的突变,最终使细胞个体具有新的表现型和基因型。Zhang等[7]通过定量比较不同诱变方法的DNA损伤和突变率,发现ARTP对单个活细胞DNA损伤更大、突变率更高。

1.3 影响ARTP诱变的因素

影响常压室温等离子体诱变的主要因素有气体气压(0.15～2 MPa)、气流速率(8～10 SLM)、组分(He)或功率(100～200 W)和诱变时间(0～999 s)等。通入等离子体中的气体组分影响了等离子体产生自由基的类型,且等离子体的形态和自由基密度均受气体流速控制,此外,气压还能影响等离子体诱变过程中细胞的存活率和活性氧自由基浓度。王纯阳等[8]研究了不同气体、不同功率和不同处理时间等大气压条件下介质阻挡放电低温等离子体对糙米的苗高、苗干重及其活力指数的影响,发现空气等离子体对促进糙米活力效果高于氮气等离子体,且不同功率下糙米近红外光谱特征出现明显差异。

2 ARTP诱变在微生物育种领域的应用

ARTP活性粒子对微生物的基因造成了损害,改变了基因序列,使微生物细胞壁膜结构和通透性都发生变化,最终致使微生物发生突变。ARTP诱变技术目前广泛应用于微生物菌种改良和提升生物合成能力等方面。

2.1 在细菌领域的应用

目前,工业上生产主要是通过微生物发酵法以利用生物质原料实现目标产物的合成,达到降低生产成本的目的。近年来,ARTP诱变技术主要用于提高细菌中目标产物(如氨基酸)的产量和菌株改良等方面。Cheng等[9]利用ARTP诱变技术获得高产L-苏氨酸的抗噬菌体大肠杆菌突变体,诱变条件:功率150 W ,处理距离2 mm,诱变时间40 s,致死率为99.4%。Xin等[10]首次将ARTP诱变处理过的深海微小杆菌菌株用于脱蛋白,脱蛋白率为91.48%,甲壳素回收率为70.18%;诱变条件:功率100 W,处理距离2 mm,气流量10 SLM,诱变时间0、20、40、60、80、100和120 s。Yi等[11]采用ARTP诱变技术筛选得到大环内酯类化合物产量分别比亲本菌株高35.2%和52.8%的芽孢杆菌突变菌株A29和A72,诱变时间为0、25、50、75、100、125、150、175和200 s。此外,利用ARTP诱变技术还可改良肠道益生菌菌种,并提高菌株的代谢产物或耐受性。Nyabako等[12]通过ARTP诱变技术提高了嗜酸乳杆菌的耐酸性,诱变条件:功率120 W,处理距离2 mm,气流量10 SLM,诱变时间15、30、45、60和75 s。Liu等[13]通过ARTP诱变技术获得了对pH 2.5和0.3%胆汁盐的耐受性有所提升的凝结芽孢杆菌突变体artp-aleBC15,进而改善菌株的益生菌性能,诱变条件:功率120 W,处理距离2 mm,气流量8 SLM,诱变时间0～30 s。上述研究表明,利用ARTP诱变技术可改变细菌的基因序列,从而改变细菌对外界的适应能力和目标产物的含量。

2.2 在放线菌领域的应用

放线菌发酵产物在食品和医药等行业有广泛应用,目前已有一些通过放线菌生物发酵高效生产活性物质的方法,其中,利用ARTP诱变技术可使放线菌发酵产物含量(如抗生素、有机酸、氨基酸、维生素、甾体等)得到大幅提升。Ye等[14]利用ARTP诱变技术提高了链霉菌合成大环聚酮化合物的产量,诱变条件:功率100 W,处理距离4 mm,诱变时间0、30、45、60、75和90 s。Yu等[15]采用ARTP结合紫外诱变处理,通过高浓度CaCl2适应性筛选获得高产阿维拉霉素的绿色产色链霉菌突变株,诱变条件:功率100 W,处理距离2 mm,气流量10 SLPM,诱变时间15～120 s、30～180 s、60～360 s、30～240 s和5～150 s。子囊霉素是免疫抑制剂吡美莫司化学合成的关键中间体,在临床应用中具有很高的价值,但它主要通过微生物发酵生产获得,目前产量仍然较低。Yu等[16]采用ARTP诱变技术获得高产子囊霉素的吸水链霉菌突变株,突变株在后期发酵间子囊霉素的产量是目前已有报道的最高产量;诱变条件:功率100 W,气流量10 SLPM,诱变时间0、30、60、90、120和150 s。Yu等[17]利用ARTP诱变使硫酸新霉素在弗氏链霉菌中的效价提高到10 849 U/mL,诱变条件:功率115 W,处理距离2 mm,气流量12 SLPM,诱变时间30～240 s。此外,ARTP诱变技术还能提高放线菌发酵培养过程中的氨基酸和酶抑制剂含量。Xiang等[18]发现经ARTP诱变处理后筛选得到的白色链霉菌突变株的细胞内代谢发生了变化,其中,L-赖氨酸合成与降解途径中上调的代谢产物可能导致ε-聚赖氨酸产量的提高。上述研究结果均表明,利用ARTP诱变技术可提高放线菌发酵后生物活性物质的产量,但具体机制还有待进一步研究。

2.3 在真菌领域的应用

ARTP诱变技术为改造真菌菌种提供了一种新方法,可获得具有目标效应(提高效价、酶活等)的突变体。Jiang等[19]运用ARTP诱变技术与H2O2驱动适应性进化方法得到虾青素效价比出发菌株提高了近4倍的酵母菌突变体菌株,诱变条件:功率120 W,处理距离2 mm,气流量10 SLM。Dong等[20]通过ARTP诱变获得高产单宁酶和高酶比活性的炭黑曲霉突变菌株,单宁酶的产量和性质的变化可能是由于诱变使酶结构和细胞代谢发生了变化。ARTP诱变也应用于提高霉菌色素产量方面。Huang等[21]利用ARTP诱变筛选得到红色素产量提高24.4 %的南极真菌突变株,且培养周期缩短了33.3 %,诱变条件:功率100 W,处理距离2 mm,气流量10 SLM,诱变时间0、30、60、90、105、150、180、210、240和300 s,为工业合成红色素提供了一种新途径。这些实验数据表明,ARTP诱变技术是一种能有效改善真菌菌种性能的技术,但其改善机制也需进一步研究。

2.4 在酵母菌领域的应用

酵母菌是工业上应用最广泛的单细胞真菌,在酿造、食品、医药等行业发挥着重要作用。利用ARTP诱变技术处理酵母菌,不仅能提高酵母菌发酵过程中目标代谢产物含量,还能降低发酵副产物含量,从而拓展酵母菌的应用范围。Li等[22]通过ARTP和适应性实验室进化法显著提高了产香酵母的NaCl耐受性,可能是由于细胞内增加了K+和去除了细胞质中Na+导致;诱变条件:功率100 W,处理距离2 mm,气流量10 SLM,诱变时间30、60、90、120和150 s。Tian等[23]利用ARTP诱变和高通量筛选方法,得到1个在低pH条件下能提高酿酒性能的酵母菌株,诱变时间为0、30、60、90、120、150、180、210和150 s。此外,ARTP还可有效减少酿酒酵母在发酵过程中乙醛含量、提高酪氨酸含量及提高啤酒的风味稳定性[24]。上述实验数据均表明,ARTP诱变技术可改变酵母菌的细胞膜内外渗透性,以及提高酵母菌的性能。

2.5 在微藻领域的应用

微藻是一种光合微生物,在合适的营养、水、CO2和光能条件下能产生和储存不同种类化合物,可作为生物发酵的原料而受到广泛关注。微藻传统育种方法存在周期长和遗传性状不稳定等缺点,从而限制了产业的发展。Cao等[25]对蛋白核小球藻进行ARTP诱变研究,诱变条件:功率120 W,处理距离2 mm,气流量10 SLM,筛选出5株产油脂高的微藻菌株,并表现出良好的遗传稳定性。ARTP 诱变处理微藻后,微藻的胞外多糖和虾青素的含量也得到大幅提高[26]。An等[27]利用ARTP诱变技术分离到1株钝顶螺旋藻突变株,其虾青素产量比出发菌株提高了196%,诱变条件:处理距离2 mm,气流量10 SLM,诱变时间30、40、50、60、70和80 s。上述研究结果表明,利用ARTP诱变技术可显著提高微藻中生物活性物质含量。

3 ARTP诱变育种在食用菌育种中的应用

高产、稳产、优质和适应性强是现代食用菌育种的需求。据报道,以食用菌的菌丝体或原生质体为材料,通过ARTP诱变技术选育优质、高产、具有优良品性的食用菌新品种,已成为食用菌育种工作中一种新的方式。目前,ARTP诱变技术已成功应用于茶树菇、灵芝、真姬菇、草菇、金针菇、猴头菇、灰树花、花脸香蘑、蛹虫草、黑木耳和桑黄等食药用菌育种工作中。

3.1 在食用菌新品种选育中的应用

利用 ARTP 诱变技术对食用菌进行诱变后的菌丝生长速度、菌丝体活性和液体发酵效率等特性均有大幅提升,有利于食用菌菌种的提纯复壮和新品种选育。韦达等[28]发现ARTP诱变处理赤芝菌丝体时,在0.5 min时菌丝生长速度最快,处理1 min时菌丝体生物量最大,诱变条件:气体流量2 L/min,电压为13 kV,放电时间0～4 min。除了常见的食用菌之外,利用ARTP诱变技术在珍稀食药用菌新品种选育上也得到了广泛应用。桑黄具有较高的食药用价值,但生产周期长,产量低,李正鹏等[29]利用ARTP诱变技术选育出具有菌丝生长速度快、产量和生物转化率都比较高的暴马桑黄新品种‘沪桑2号’,其子实体中的粗多糖与总黄酮含量高于出发菌株。Li等[30]通过ARTP诱变方法筛选出1株高产的桑黄菌株A130-20。上述研究结果表明, ARTP诱变技术可作为选育商品性状优良的食用菌新品种的新方式。

3.2 在提高食用菌活性成分上的应用

食用菌中含有多种生物活性成分,如多糖、萜类化合物、甾醇类化合物和酮类化合物,具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老和抑菌等功效,通过ARTP诱变技术可提高食用菌活性成分的含量,进而提高食用菌的药用和保健价值,推动产业发展。马娜娜等[31]利用ARTP诱变技术对灰树花的复壮株P-2菌丝体进行诱变,诱变后菌丝中的多糖含量得到了提高,诱变时间为10、20、30、40、50和60 s。Gong等[32]通过ARTP诱变技术获得发酵菌丝中多糖含量高于出发菌株的2个猴头菇突变株HEB和HEC。此外ARTP诱变技术在提高食用菌中蛋白质和氨基酸含量上有广泛应用。刘广建等[33]通过ARTP诱变技术筛选到蛋白产量达6.5 g/L(200 L发酵罐)的蛹虫草菌株,降低了食用菌蛋白生产的成本,诱变条件:功率120 W,处理距离2 mm,气流量10 SLM,诱变时间0、20、40、60、80、100、150、180和240 s。上述试验结果表明,通过ARTP诱变技术可有效提高食用菌中有效活性成分的含量。

3.3 在提高食用菌抗逆上的应用

食用菌在生长过程中对环境要求较高,需要在一定的条件下才能得到最高商品价值,因此,需要提高食用菌的抗逆能力,如对环境胁迫的抗耐性,从而提高食用菌的经济价值。李春霞等[34]利用ARTP诱变真姬菇的原生质体,获得了产漆酶能力高的突变菌株,为真姬菇生产提供了助力。杨茹等[35]通过ARTP诱变技术得到抗托拉氏假单胞菌能力比出发菌株AR0分别提高了15.49%和1.9%的2个金针菇突变株,诱变条件:处理距离10 mm,气流量16 SLM,诱变时间25 s。

4 ARTP诱变结合其他诱变技术在微生物和食用菌育种中的应用

除了单独利用ARTP诱变技术进行微生物和食用菌育种研究外,还可通过ARTP诱变技术结合其他诱变技术获得目标突变株,不仅能有效避免单一诱变剂产生的诱变饱和效应,还可提高正突变率,减少育种工作量,缩短选育优质目标菌株的时间,提高育种效率。Xia等[36]通过紫外诱变、ARTP诱变和UV-ARTP诱变技术相结合处理塔宾曲霉,经过5轮反复诱变,筛选出柚皮苷酶产率分别提高了79.08%、123.56%和206%的3个突变体。目前复合诱变在食用菌中的应用还很少,现仅有结合利用60Co-γ射线和ARTP诱变技术选育出产量高和性状遗传稳定的蛹虫草突变菌株[37]。

5 展望

随着产业的迅速发展,尤其是合成生物学的快速发展,利用微生物生产大众化工材料,或利用食用菌生产植物蛋白质,都是以较低的成本创造最大的效益,开启了企业发展新模式,从而快速推动了微生物和食用菌产业的发展。但目前的困境之一是缺乏优异的前端资源支持,因此,亟需培育出优良的微生物和食用菌品种以满足发展的需要。高性能的工业生产菌株的构建和育种是直接影响生物技术产业的关键,对各种微生物进行快速有效的体外基因突变研究是快捷有效的方法之一,且诱变材料在诱变后产生预期稳定的表型是研究者的最终目标。目前,利用常规育种技术选育微生物和食用菌新品种,工作量较大,效率较低,尤其是食用菌品种的选育周期长,获得具有优良性状的目标品种也比较艰难。利用新兴技术——ARTP诱变育种技术可提高诱变效应,获得期望突变体的效果,创制出具有目标性状的种质资源,加快了新品种的选育过程。

诱变育种技术是用于提高世界上主要微生物及食用菌的产量、质量和适应性的重要技术之一,对解决许多国家的营养安全问题具有重要作用,而全球经济发展变化和环境改变对微生物及食用菌产业带来的风险和日益增长的生产需求,要求在菌种改良和提高目标产物的技术方面需要更加精准。近年来,利用ARTP诱变育种技术选育新品种和提高活性物质产量等方面取得了一定的进展,但还存在一些问题:(1)ARTP诱变技术产生的多种活性粒子如何作用于生物大分子和整个细胞机制尚未清楚。(2)微生物和食用菌中含有多种生物活性物质,通过ARTP诱变提高微生物和食用菌中某些活性成分含量的作用机制也尚未可知,活性物质之间是否存在相互作用,以及经ARTP诱变后所含活性成分的抗氧化、抗肿瘤或免疫调节等功能的调控机制是否发生变化少有研究。(3)利用ARTP诱变技术选育出的具有优良性状的新品种或突变株是否能稳定遗传,在继代培养后是否会恢复原有性状,以及是否能在实际生产中进行大面积推广应用,如何保持突变株的优良性状是在诱变选育过程中需要持续解决的技术问题,还需通过大量试验进行探究和验证是否能商业化应用。(4)在食用菌中主要是以菌丝体或原生质体作为诱变材料,需要大量时间筛查品种的致死率和对突变菌株的表型进行筛选鉴定,目前还未深入到分子层面,因此,利用ARTP诱变技术选育食用菌新品种的遗传机制还需要进一步研究。(5)ARTP诱变技术作为一种快速基因组突变方法,是通过等离子体对微生物的致死产生的诱变效应,但等离子体和微生物细胞之间相互作用的机理还未有研究。

微生物和食用菌育种面临诸多的机遇和挑战,利用高通量测序、转录组和蛋白质组等技术阐明ARTP诱变微生物和食用菌的遗传规律,以及加强目标菌株快速筛选的研究,是今后研究工作的重点,这对提高我国微生物和食用菌诱变育种水平和推动产业的可持续发展具有重要作用。此外,食用菌育种可将ARTP诱变技术与菌落形态和特定生长率指数筛选、适应性实验室进化、高通量筛选等方法相结合,有助于ARTP诱变处理后高效获得表型或功能符合要求的突变体,从而缩短育种周期。以及辅助结合先进的生物信息学、分子生物学和光谱等技术,如通过光谱技术找到诱变处理的变化位点及空间定位,从而揭示ARTP诱变机理;或通过RNA干扰及过表达技术和转录组学及蛋白组学揭示经ARTP诱变处理后,所含活性成分合成调控机制。