Dof转录因子在作物逆境胁迫响应及农艺性状改良中的作用

王泽民, 晋 昕, 张飞燕, 司怀军

(甘肃农业大学生命科学技术学院, 兰州 730070)

转录因子(transcription factors,TF)是一种蛋白质,它结合在目标基因启动子区域的特定DNA基序上,调节其转录。植物体内近7%的基因转录产生TFs,已知TFs参与应对干旱、渗透、高温和低温等非生物胁迫[1-3]。植物TFs根据其DNA结合结构域被分为约58个家族[1]。许多TFs(如Dof、WRKY、ERF、NAC、GRAS和MYB等)在与非生物/生物胁迫反应和许多发育/生理过程相关的信号和调节网络中起至关重要的作用[1-4]。虽然大量研究证实Dof广泛参与植物生长发育和胁迫响应等过程,同时影响作物重要农艺性状,如品质、产量、植株结构、开花时间和器官发育等,但仍然存在很多未知,对Dof家族具体成员相关功能和调控方式的研究并不完善,每个成员在多种复杂的环境条件下的响应机制尚不清晰。因此,仍需进一步了解和研究,为利用Dof转录因子提供更多理论依据。本文结合非生物胁迫(干旱、极端温度、盐胁迫等)和生物胁迫对作物生长发育的影响,从信号转导、基因表达调控和重要次生代谢产物变化等方面,重点综述Dofs家族成员在作物胁迫响应和作物重要农艺性状方面的多重功能,以期为Dofs在作物改良和抗逆性生物育种中的潜在功能及应用提供参考。

1 Dof转录因子

DNA-binding with one finger (Dof)蛋白是植物特有的转录因子大家族。在模式植物拟南芥等物种的研究中发现,Dof蛋白长度在200到400个氨基酸之间,通常由保守的DNA结合域(N端)和一个转录调控区(C端)组成[4]。Dofs转录因子的另一个重要特征是高度保守的核定位信号(NLS),它可以引导这些蛋白质到达细胞核。这个长达17个氨基酸的NLS在本质上有两部分,与Dof DNA结合结构域下游末端相连,这一特性允许在一些植物中识别Dof[5-6]。随着越来越多植物基因组测序项目完成,Dof转录因子家族也在更多植物中得到全面鉴定。在模式植物拟南芥和水稻中分别发现了36和30个Dofs成员[7-8],西红柿34个,西瓜和黄瓜均为36个[9],无芒隐子草50个[10],苹果60个[11],大豆和白菜中较多,分别为76和78个,小麦中最多有96个[12]。根据蛋白序列相似性,Dof转录因子可分为A、B、C、D 4个组或亚组,B、C、D组可进一步细分[13-14]。不同组或亚组Dof转录因子可能存在功能特异性。例如,B组的CDFs亚组是将植物对不利环境条件反应与植物生长控制和发育不同方面(如光周期开花时间或根和芽生长)结合起来的关键元素[15-18]。CDF蛋白,通常在其C端区域包含特定的结构域[8,19],如时钟基因GIGANTEA(GI)和FLAVIN BINDING KELCH REPEAT F-BOX PROTEIN 1(FKF1)结合结构域[15],已知这些结构域通过蛋白质-蛋白质相互作用参与翻译后调控[20-22]。此外,一些CDF蛋白在N端也含有一个非EAR基序样结构域,这是与辅抑制因子TOPLESS蛋白相互作用所必需的[16]。

1.1 Dof转录因子识别的顺式作用元件

研究发现大多数Dofs只有一种类型的DNA结合区和寡聚区,尽管有些缺乏转录调节区域或特定的DNA结合区[23]。研究人员通过不同的体外和体内方法分析了Dof结构域的DNA结合活性,发现所有检测的Dof都与DOFCORE[5′-(A/T)AAAG-3′]结合[5]。在拟南芥中,通过DNA亲和纯化测序(DAP-seq)技术对529个转录因子进行系统研究,所有39个Dofs转录因子都具有上述启动子结合偏好[24]。在拟南芥体外分析中报道了类似的观察结果[20,25],也包括马铃薯[21]和番茄[22,26]等其他植物。以上实验阐明了AAAG基序在Dof转录因子识别DNA中的重要性,以及优先结合(A/T)AAAG而不是(G/C)AAAG。与其他植物转录因子相比,Dof转录因子识别的DNA序列相对较短[27]。由于Dof转录因子识别的是一个相对较短的序列,推定Dof结合位点在许多基因的启动子序列和转录调控区域中非常常见。然而,大多数可能是体内无功能的部位。此外,Dof转录因子可能需要与其他转录因子相互作用,结合DNA或在基因组的精确位点上调节转录。

1.2 Dof转录因子与其他转录因子相互作用协同或拮抗调控下游基因表达

Dof结构域不仅可以介导DNA与蛋白质,也介导蛋白质与蛋白质相互作用。Dof转录因子与其他蛋白结合:一些通过Dof结构域介导,而另一些则涉及Dof结构域外的氨基酸序列。研究显示,Dof蛋白的C端基序在蛋白质-蛋白质相互作用中起关键作用。Dof蛋白C端激活域的结构不同,导致Dof蛋白在碳氮同化[28]、光介导生物钟[22,29]、气孔功能[30]、种子萌发[31]、激素反应[32]、植物防御[33]、细胞周期[34]和果实成熟[35]等方面的功能不同。在拟南芥中,通过筛选cDNA文库发现第一个互作蛋白,即植物蛋白OBP1(OBF-binding protein)[36]。植物中prolamin box(P-box)是一个高度保守的7 bp序列元件(5′-TGTAAAG-3′),存在于许多谷物种子贮藏蛋白基因的启动子中。研究显示,Dof转录因子PBF具有P-box(PB)结合特性。PBF能够与一种已知的调控玉米醇溶蛋白基因表达的转录激活因子basic leucine zipper protein (bZIP) Opaque2(O2)相互作用,其靶点位于22 ku玉米醇溶蛋白(zein)基因启动子中P-box下游20 bp处。Dof蛋白与AAAG DNA序列基序结合及其与相邻启动子位点bZIP因子的相互作用表明,Dof蛋白、PB和O2之间的类似相互作用可能发生在22 ku zein基因启动子上[37]。

Dof-MYB相互作用也是通过BPBF的C端介导,而不是通过Dof结构域[38-39]。研究显示,Dof转录因子能够与参与赤霉素(GA)调控基因表达(GAMYB)的R2R3型MYB蛋白相互作用,这种相互作用对谷粒萌发过程中GA诱导糊粉层水解酶基因的表达起关键作用[40]。大麦MYB转录因子HvGAMYB通过与5′-TAACAAC-3′或5′-CAACTAAC-3′基序结合反式激活Hor2和Itr1启动子的转录,激活Hor2启动子也需要一个完整的PB。HvGAMYB通过与BPBFC端结构域相互作用增强BPBF的反式激活能力[38]。反式激活实验以HvGAMYB作为效应器,通过与种子特异性转录激活因子BPBF可激活与PB结合的Hor2启动子的转录。即使在Hor2启动子中MYB binding位点发生突变的情况下也可以被BPBF激活。相反,具有突变PB的Hor2启动子缺乏与BPBF结合的能力,不能被HvGAMYB激活,无论其DNA结合基序是否完整[41]。类似于O2[37]蛋白,MYB蛋白激活靶启动子的转录需要MYB结合位点和Dof结合位点。拟南芥中参与花器官脱落调控的AtDOF4.7与另一种与脱落相关的转录因子ZINC FINGER PROTEIN 2相互作用[42]。在香蕉中,MaDof23是一个转录抑制因子,而MaERF9是一个转录激活因子。通过相互结合拮抗调控10个与细胞壁降解和香气形成相关的成熟相关基因[43]。在植物中作为种子萌发负调控因子的AtDof3.2与种子萌发正调控因子TCP14相互作用,并阻碍TCP14调节ABA相关基因的表达[44]。

除了与其他转录因子相互作用外,Dof转录因子还可以与HMG-box(HMGB)家族染色质相关HMG蛋白等发生相互作用[16,23]。HMGB蛋白包含一个HMGB DNA结合结构域,与DNA非特异性结合。同时HMGB结构域可以与Dof转录因子的Dof结构域相互作用[23,45]。研究人员发现了5种不同玉米HMGB蛋白以不同的效率增强玉米Dof2与DNA的结合[23]。此外,蛋白激酶CK2对HMGB1的磷酸化消除了HMGB1与Dof2之间的相互作用[23],表明HMGB蛋白的磷酸化参与了对Dof2活性的调节。虽然一些HMGB蛋白参与了转录调控,但它们并不是真正的转录激活因子[23]。它们与Dof转录因子的相互作用可能在特定结合位点的选择或在体内增强转录因子与DNA的结合方面发挥作用。TOPLESS(TPL)蛋白是植物多种分子途径(激素信号和胁迫信号等途径)中常见的重要辅助转录抑制介质,可协助转录因子介导对靶位点的抑制[46]。拟南芥CDF是CO等开花途径基因的转录抑制因子[16-17]。研究发现,当CDF1丰富时,CDF1和TPL形成一个蛋白质复合体,抑制CDF1与下游基因启动子的结合进而减少CO和FT的转录。同时,对CDF1和TPL相互作用结构域的分析表明,CDF1与TPL相互作用的区域是完全抑制活性所必需的[16]。此外,小泛素样修饰物(SUMO)靶向泛素连接酶(AT-STUbL4),通过与CDF2结合引导CDF2的泛素化降解,提高COmRNA水平,通过光周期促进开花[47]。由此表明,Dof转录因子通过与转录因子等蛋白互作在多个维度发挥调控作用。

2 Dof转录因子在植物逆境响应中的作用

2.1 干旱与盐胁迫

非生物胁迫如干旱和盐碱是限制植物生长、发育和产量的重要环境因素。干旱和盐碱能诱导植物细胞的高渗透胁迫[48]。在拟南芥中,盐胁迫诱导Dof1.7、Dof2.5、Dof3.6、Dof5.1和Dof5.5的转录。AtDof5.8调控ANAC069的表达,并响应盐、干旱和ABA胁迫。在油菜中,9个经筛选的Dof基因可在盐、干旱、热、冷胁迫下表达上调。在干旱条件下,野生种葡萄VyDof8通过提高关键酶的抗氧化活性降低丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)含量,进而增加植株抗旱性[49]。苹果中共有54个Dof成员,大多数基因能够响应非生物胁迫(干旱和盐胁迫)诱导表达[11,50]。MdDof54在苹果抗旱响应中发挥重要作用。经过长期干旱胁迫后,MdDof54RNAi植株高度显著降低,根系明显变弱;过表达MdDof54的植株则具有更高的成活率。转录组及DAPseq和ChIP-seq分析证明MdDof54能够识别包含AAAG基序的顺式元件,可能通过调控下游干旱胁迫响应基因的表达,进而调控苹果抗旱性[51]。

研究人员发现一个中心调控因子,为马铃薯植物成熟和块茎发育起始的主效应数量性状位点。研究表明,该基因属于Dof转录因子家族,通过在生物钟和StSP6A结节化信号之间充当中介,调控结节化和植物生命周期长度。该基因自然的等位基因变异导致其逃避翻译后的光调控,提出了时钟输出蛋白StGI和StFKF1调控转录调控因子StCDF1丰度诱导马铃薯块茎形成的模型。StCDF1通过下调StCO1/2,抑制StSP5G的转录,进而促进StSP6A的表达,诱导匍匐茎末端的块茎发育,这使得马铃薯可以在起源的地理中心以外正常种植[21]。Ramirez等[30]研究表明StCDF1参与干旱胁迫响应,该位点与长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)对应物StFLORE通过影响气孔发育和每日开放来调节水分流失。研究显示,StFLORE转录本中的自然突变和CRISPR-Cas9突变使植物对限水条件的敏感性增加。相反,StFLORE的表达升高,无论是StFLORE的过表达还是StCDF1的下调,都会通过减少水分流失增加对干旱的耐受性。尽管StFLORE似乎是一种天然的反义转录,但它反过来受StCDF1转录因子的调控。因此,StCDF1-StFLORE基因位点对马铃薯植株的营养繁殖和水分平衡具有重要作用[30]。拟南芥AtCDF1-5基因的表达水平都在不同的非生物胁迫下发生变化,包括干旱、盐渗透胁迫、寒冷或高温[17,25]。番茄的SlCDF1-5同源物已被证明是参与响应盐度和干旱条件以及控制开花时间的转录调控因子[22,28]。表达分析显示,所有SlCDFs对不同的非生物胁迫(如盐、干旱、高温和低温)具有不同的根和芽的表达模式,表明番茄SlCDFs在非生物胁迫响应中发挥重要作用[22,28]。番茄SlCDF1和SlCDF3的异源过表达拟南芥增加了对盐和干旱胁迫的耐受性,通过诱导COR15、RD29A和ERD10等广泛的非生物胁迫应激响应基因的表达[22]。此外,也有报道称,过表达SlCDF3基因的番茄植株对盐胁迫具有更高的耐受性[28]。综上所述,Dofs可能在盐胁迫和干旱响应途径的上游发挥关键调控作用。

与此同时,通过对陆地棉花在盐胁迫下转录组数据和cDNA文库分析,在棉花(Gossypiumspp.)中,200 mmol/L NaCl处理诱导26个Dof家族基因上调表达[52],同时17% PEG6000处理诱导10个Dofs成员上调表达[53]。OsDof15能够直接结合乙烯生物合成基因OsACS1的启动子,在初生根发育早期抑制其转录,导致乙烯生成显著减少,从而调节初生根活力的分生组织活性。同时,OsDof15的转录也受到盐胁迫的抑制,过表达OsDof15降低了转基因植株主根对盐的敏感性。这些结果阐明了乙烯抑制主根伸长的分子机制,为根系发育过程中环境信号和发育信号的协调提供了理论依据[54]。此外,耐盐甜菜BvM14-Dof3.4基因的异源表达能够促进盐胁迫下转基因拟南芥植株根的生长,提高异源表达植株的鲜重和干重,通过增加K+/Na+比、甜菜碱含量以及SOD和POD的酶活性,从而减少盐胁迫对异源表达拟南芥植株的损伤[55]。ThDof1则通过增强活性氧(ROS)清除能力,提高刚毛柽柳耐盐性和渗透性[56-57]。

2.2 温度胁迫

植物进化出了感知环境温度轻微变化的信号通路,并调整其新陈代谢和细胞功能,以防止与温度相关的损伤[48]。由于全球变暖和伴随而来的极端天气事件,植物越来越多地受到冷和热等温度胁迫[48]。温度胁迫降低植物生产力,威胁粮食安全。GI是多种信号通路的中心,包括生物钟调节、糖和光信号通路、光周期和应激反应(包括低温和干旱等)[17,58-59]。研究结果表明,在GI-CDF模块中,CDFs通过调控C-REPEAT BINDING FACTOR(CBF)进而调控参与非生物胁迫响应基因[25,60]。在某些情况下,CDFs已被确定为参与控制非生物胁迫反应的CBF/DREB转录调控网络的一部分[25,28]。例如,拟南芥AtCDF3在非生物胁迫中调节多种胁迫响应转录因子(如CBFs、DREB2A和ZAT10),这些转录因子既涉及GI依赖通路,也涉及GI独立通路[25,28]。类似的,与拟南芥CDF1同源的甘蓝型油菜BnCDF1通过调控不同非生物胁迫响应基因,如CBF1、CBF2、COR15A和RD29A,正调控油菜抗寒性[61]。这些数据表明,Dof/CDFs对CBF基因的调控可能是低温等非生物胁迫响应信号级联的初始步骤。

同样,在作物中Dof蛋白通过调控合成脯氨酸和可溶性糖等一系列渗透调节物质,提升植物抗逆性。在甘蔗中,12个Dof家族成员受低温诱导表达[62]。研究人员在基因组和转录组水平上研究了葡萄中25个VaDof基因,结果显示其中11个VaDof基因在冷胁迫下显著差异表达。通过对35S::VaDof17d葡萄愈伤组织mRNA的比较测序,发现VaDof17d与冷响应途径和棉子糖家族寡糖(RFOs)密切相关,VaDof17d可以通过上调半乳糖苷合酶(GolS)和棉子糖合酶(RFS)基因。而Dof17d-ED(CRISPR/Cas9介导的Dof17d突变体)的冷耐受性显著降低,同样在冷胁迫下RFOs水平出现显著降低,表明VaDof17d通过调控冷胁迫途径基因和RFOs水平调控葡萄的抗寒性[63]。此外,过表达GhDof1同时提高了陆地棉的耐盐和耐冷性[64]。在胡杨(Populuseuphratica)和南京菊(Chrysanthemumnankingense)中,Dof蛋白也参与了控制低温感知过程[65]。

高温胁迫几乎会对作物发育、生长、繁殖和产量的所有方面产生不利影响。在甘蔗中有5个Dof成员受高温诱导表达[62]。而在长时间热胁迫下,小麦叶片中3个Dof编码基因(TaDof5、TaDof17和TaDof19)表达下调[12]。对辣椒中Dof转录因子的全基因组鉴定和表达谱研究表明,一些Dofs编码基因可作为盐和热胁迫的生物标志物[66],但热响应的功能表征和激活机制尚不明确。在核桃中,研究显示JrDof3和JrGRAS2在热胁迫下具有相似的表达模式。酵母单杂交、瞬时表达和染色质免疫沉淀(ChIP-PCR)分析表明,在热胁迫下,JrDof3能够特异性结合位于JrGRAS2启动子区的AAAG基序。在热胁迫下,JrGRAS2的转录水平显著上调。在拟南芥中过表达JrGRAS2与野生型拟南芥相比,过表达株系在高温胁迫下种子萌发率、鲜重积累量以及过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性均显著提高。同时,与野生型相比,转基因幼苗电解质渗漏(EL)率、过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)含量均降低。因此,JrDof3作为JrGRAS2的上游调控因子,通过调控热激蛋白的表达提高植物的耐高温性[67]。这将为利用生物育种培育适应气候变化挑战的新品中提供关键分子元件。

2.3 其他

Dof蛋白在作物衰老、C/N调节、光合作用调节、叶绿体发育等过程中也发挥重要作用[28,35,64,68]。MYC2是JA信号中央调节器。研究表明,AtDof2.1直接激活MYC2启动子,通过促进MYC2的表达增加叶片衰老,MYC2也被鉴定为一种负责JA诱导的Dof2.1表达转录激活因子。因此,Dof2.1通过MYC2-Dof2.1-MYC2反馈转录环作为JA诱导叶片衰老增强子[69]。在水稻中,OsDof24(Oryzasativa)能够抑制叶片衰老。在野生型水稻叶片中,OsDof24的表达在自然衰老(NS)和暗诱导衰老(DIS)过程中迅速下降。研究显示在OsDof24启动子中含有一个增强诱捕T-DNA的功能获得突变体OsDof24-d,在NS和DIS期间表现出延迟的叶片黄变。在DIS期间,过表达OsDof24的转基因植株则表现出相同的表型。在暗培养过程中,OsDof24-d突变体的叶绿素降解基因(NYC1、NYC3和SGR)下调表达。而激素处理显示,只有茉莉酸甲酯能诱导OsDof24的表达。此外,OsDof24-d中茉莉酸生物合成相关基因(OsLOX2、OsLOX8、OsHI-LOX、OsAOS1和OsAOS2)的表达也显著降低,导致内源茉莉酸水平降低,从而使叶片衰老延迟。研究显示,OsDof24通过与茉莉酸合成途径关键基因OsAOS1的启动子区结合调控茉莉酸的合成。综上所述,OsDof24通过降低茉莉酸盐生物合成抑制营养生长过程中叶片衰老的诱导。在番茄CDFs中,CDF3可能在拟南芥和番茄的初级代谢和生长控制中发挥重要作用[17,22,25,28]。在渗透胁迫条件下,AtCDF3和SlCDF3基因在番茄中过表达可提高产量[28]。这些改善与转基因番茄植株的光合速率增加有关,进而增加蔗糖的有效利用和促进生长[25,28]。与此同时,CDF3过表达植株表现出较高的气孔密度和叶肉细胞电导系数,以及渗透胁迫下较高的Rubisco羧化作用和三糖利用率。通过分析过表达AtCDF3的拟南芥和番茄植株,结果显示初级代谢关键基因被诱导表达,包括丙酮酸激酶(PK)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脱羧酶(GAD),这与谷氨酰胺和天冬酰胺等氨基酸含量较高相关,并改变了TCA周期的代谢物[25,28]。这些代谢物是在非生物胁迫条件下合成的,作为渗透保护液,保护膜系统和活性氧清除或次生代谢物的前体[70-71]。此外,由于高盐会降低营养吸收并影响植物内部的营养分配,研究人员分析了在盐胁迫下CDF3过表达植物产量的提高是否是由于减少了钠积累和降低了毒性,并测定了转基因植物中的矿物质组成。生长抑制通常与营养组织内部Na+和K+的高度缺乏有关。通过测定过表达AtCDF3和野生型植株在对照和盐度条件下生长15 d的叶片、茎和根中钠、钙、镁、钾和磷酸盐的总含量显示,在盐度条件下野生型植株表现出显著的矿物质流失,而在AtCDF3过表达植株中,这些元素的含量保持不变,从而避免盐胁迫引起的矿物质缺乏[28]。

土壤贫瘠也是作物生长的逆境条件之一。氮(N)是植物生长发育必不可少的营养素,是大量细胞分子的成分,包括氨基酸、核酸、叶绿素、植物激素等[72]。同样,作物氮素利用效率(NUE)是一个备受关注的问题。在寻找操纵氮素利用效率的目标方面的研究表明,Dof转录因子在光合作用基因的表达中起主调控作用,从而促进作物氮的同化[72-74]。叶绿素(chlorophyll)是氮素利用的标志,过表达拟南芥Dof1能够显著增加转基因烟草的叶绿素含量,同时增强低氮条件下转基因烟草的氮同化效率[73]。与对照相比,转基因植株中几乎所有氨基酸都有不同程度增加,差异最大的氨基酸是Glu和Ser家族,而Glu是氮利用效率的良好分子标记[75],结果表明,Dof1过表达影响了转基因植物对N的同化[74]。对不同氮处理下生长的小麦品种的研究表明,在低氮处理下TaDof1的表达显著上调[76]。在拟南芥和水稻中过表达玉米ZmDof1,已被报道能促进低氮条件下的氮同化和生长。然而,与拟南芥和水稻的结果相反,在不同低氮条件下,导入ZmDof1基因并不能促进转基因杨树在大田和温室中的正常生长。研究显示与氮同化和碳固定相关的基因没有表达,氮/碳浓度和光合速率没有增加[77],这可能在不同物种中存在差异。此外,ZmDof1和ZmDof2转录因子与玉米多个碳代谢相关基因的表达相关,通过增强胞质型磷酸二激酶(cyPPDK)基因和非光合作用PEPC基因的转录,进而调控植物特异的碳代谢途径[78]。氮素再利用也是保证植物氮素供应的关键过程[72,79]。研究人员对Dof转录因子家族在茶树氮重组中的潜在功能进行了分析[79]。在茶树新梢发育过程中,大多数CsDofs在新梢发育为一芽两叶时达到峰值。此外,CsDof13/16/29/33/34/35/36/39与GDH、GS等N代谢相关基因的表达模式显著相关,表明CsDofs可能在调控茶叶N代谢相关基因的表达中发挥作用[79]。

3 Dof转录因子在作物农艺性状改良中的作用

3.1 分枝与株型

分枝是植物生长发育过程中最重要的过程之一,直接关系到植物生物量和作物产量。过表达OsDof12会导致水稻叶片直立减少,叶片缩短,穗小,导致一次枝和二次枝数量减少[80]。OsDof12过表达系的直立叶片性状使高密度种植成为可能,从而提高产量。对世界范围内水稻种质资源进行单倍型关联分析为抽穗期缺失遗传力提供了关键线索,其中30个Dof基因中有22个与抽穗期相关。CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术靶向的30个Dof基因中,有11个基因发生突变(OsDof1、2、8、9、11、16、21、22、24、26和29),显示抽穗期、株高或两者均有显著表型变化[81]。水稻OsDof11在光合器官的维管细胞和各种库组织中表达。与野生型植株相比,osdof11突变株为半矮秆植株,分蘖少。糖转运率分析显示,与野生型相比,osdof11植株的糖转运量明显减少。4个蔗糖转运体(SUT)基因OsSUT1、OsSUT3、OsSUT4和OsSUT5以及两个糖输出的转运体(Sugar Will be Export Transporters, SWEET)基因OsSWEET11和OsSWEET14的表达在突变体的各个器官中均发生了改变。染色质免疫沉淀试验显示,OsDof11直接结合SUT1、OsSWEET11和OsSWEET14的启动子区域调控其转录。结果表明,OsDof11通过调控水稻SUT和SWEET基因的表达来调节糖转运[82]。同样,在拟南芥中,苜蓿MtDof32通过调控分支调节基因调节分枝数。此外,过表达MtDof32的拟南芥叶和花大小均显著增加,这与关键器官增大基因表达上调有关(ERBB-3BINDINGPROTEIN1;AtEBP1;ARGOS-LIKE,AtARLandAtKLU)[83]。综上所述,Dofs转录因子在芽分枝和器官相关性状中发挥重要作用。

3.2 开花时间

开花时间在农业生产中也非常重要,而GI在光周期开花中的作用最为突出[84]。在拟南芥中,转录组分析显示,GI和CDFs虽然具有拮抗作用,但在下游基因表达方面比CO和FT有更广泛的影响,尽管如此,参与生物钟节律的基因是由GI独立于CDFs调控的[17-18,20]。马铃薯StCDF1是一个中心调控因子,StCDF1等位变异也可能是形成马铃薯在夏季/冬季日长变化大的纬度地区(如安第斯山脉)驯化的基础,因此可能是在新的地理区域进行量身定制育种的一个极好目标[21]。此外,利用CRISPR/Cas9在TP309(粳稻品种)中对所有30个水稻OsDof基因进行敲除突变体的研究取得成功[85]。其中12个OsDof基因的敲除株系(OsDof04-09、14、19、22、25、26、28和30)都有一个共同的作用,即生长发育不良和无法过渡到开花。低温、干旱、盐胁迫和赤霉素(GA3)胁迫高度诱导PheDof12-1的转录水平。过表达PheDof12-1的转基因拟南芥在长日(LD)条件下开花早,而在短日(SD)条件下开花时间不受影响。酵母单杂交实验表明,PheDof12-1可以与PheCOL4启动子序列结合。同时PheDof12-1表现出强烈的昼夜节律,光处理抑制,暗处理诱导[86]。番茄Dof蛋白TDDF1,同时参与调节昼夜节律和抗逆性。在转移到连续黑暗(DD)或光照(LL)条件后,TDDF1的表达仍保持较大的每日波动。过表达TDDF1通过上调番茄花期调控基因表达,以及与花诱导剂SFT蛋白互作,诱导番茄早花[26]。

3.3 其他

大豆是油料作物中最重要的豆科种子作物之一。研究显示,大豆GmDof4和GmDof11过表达转基因拟南芥种子中总脂肪酸和脂类含量增加。进一步分析显示其通过直接结合下游基因启动子区顺式作用元件激活乙酰辅酶羧化酶基因和长链辅酶CoA合成酶基因转录,进而调控脂质代谢[87]。以上结果表明,GmDof通过上调与脂肪酸生物合成相关的基因表达来提高大豆种子的脂质含量。近年来因棉清油含有大量人体必需的脂肪酸和较高的亚油酸含量,棉籽也被用作重要的油料原料。研究发现棉花中过表达GhDof1能够显著提高棉花的耐盐性和耐寒性[64]。过表达GhDof1基因可使棉籽含油量增加16%以上[64],这与GmDof4具有相似的调节种子含油量(种子含油量提高了20%以上)的功能[87]。表明部分Dofs是提高油料作物非生物耐性和籽油含量的功能性转录因子。此外,番茄CDF3基因的过表达能够改变番茄果实中有机酸和糖含量,改善果实风味和品质[28]。这对增加作物产量和改良风味品质具有重要意义。

4 结语

干旱、盐和温度胁迫等是影响自然界植物地理分布、限制农业植物生产力和威胁粮食安全的主要环境因素。气候变化加剧了这些非生物胁迫的不利影响,也给作物可持续和高质量生产以及粮食安全带来新的挑战[88]。通过调节蛋白质-DNA和/或蛋白质-蛋白质相互作用中的多种转录因子,Dof家族成员可能参与对不同非生物胁迫反应的调控,也可能参与作物发育与逆境胁迫的调节,如开花时间和逆境胁迫等。同时,Dof转录因子可以直接或间接参与作物与C和N代谢相关的各种信号通路的交叉作用。因此,分析研究Dofs调控作物代谢稳态、胁迫反应和生长发育的分子机制非常重要。Dof蛋白可能作为上游调控因子,在调控作物逆境胁迫及农艺性状改良中扮演重要角色。然而,只有少数作物Dof蛋白功能被鉴定。Dof转录因子在响应各种胁迫时表现出多重、相互关联的表达模式,可以利用这些模式通过生物育种使作物品种实现多特性聚合改良等种源创新,获得高抗性和理想农艺性状兼具的作物品种。