rAAV5阴离子交换层析工艺的开发

许 琳, 梁欢欢, 李红英, 韩 旭, 戴柳冰, 马 超, 朱 涛,

(1. 天津科技大学生物工程学院, 天津 300457; 2. 康希诺生物股份公司, 天津 300000)

腺相关病毒(Adeno-Associated Virus,AAV)最早于20世纪60年代在实验室腺病毒制剂中发现[1-2],随后不久在人体中发现[3]。AAV是一类无包膜、直径20～26 nm的二十面体结构,含有4.7 kb的单链DNA基因组,属于细小病毒家族[4-6]。由于其安全性好、宿主范围广(分裂和非分裂细胞)、物理性质稳定,并且感染人体后不会导致任何生理或病理变化而成为基因治疗最具应用前景的载体之一[7-8]。目前,以AAV为载体成功用于临床基因治疗的药物有3种,即Glybera(AAV1)、Luxturna(AAV2)和Zolgensma(AAV9)。不同的AAV血清型具有不同的组织趋向性,已被证明在肺、肌肉、大脑、脊髓、视网膜和肝脏等多种组织中可以进行长期有效的表达[9-10]。

基因治疗产品的质量对临床药物的安全性至关重要。使用三质粒转染人胚肾细胞(HEK293)时,病毒包装成实心载体的过程往往是低效的,导致在生产制备过程中形成缺乏载体基因组的空颗粒[11-12],病毒空颗粒被认为是最难以去除的杂质。Gao等[13]研究表明去除AAV制剂中的病毒空颗粒会提高AAV在临床应用中的治疗效果和安全性。使用氯化铯梯度超速离心法纯化的AAV载体已被用于一些临床试验中,然而这些纯化方法并不容易工艺放大[14]。最近阴离子交换层析、阳离子交换层析和凝胶过滤层析被报道用于分离病毒空颗粒,然而这些方法主要是针对AAV1-6、AAV8和AAV9[15-17]。本研究使用亲和捕获后的rAAV5样品,进行层析填料与层析柱的筛选,根据筛选结果作进一步纯化体系和方法的优化。最终可以得到符合产品质量要求的病毒载体,为rAAV5载体工业生产放大提供了一种方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒载体

采用三质粒共转染的方式进行上游发酵,收获的发酵液需粗纯(裂解,酶解与澄清)去除杂质,然后进行亲和层析,但是亲和层析捕获的rAAV5样品中仍然含有大量的病毒空颗粒(一般在70%～95%),需进一步进行精纯优化,使得样品符合质量要求(实心载体比率大于70%)。

1.1.2 填料与层析柱

SOURCE 30Q(Cytiva公司);Q ImpRes(Cytiva公司);NanoQ-30L(苏州纳微科技有限公司);MC30-Q(苏州赛分科技股份有限公司);CIMmultus QA层析柱(BIA Separations公司);CIMQ AAV full/empty 0.1 mL analytical column(BIA Separations公司)。

1.1.3 主要仪器与试剂

AKTA avant 150层析系统(Cytiva公司);新型XP Cycler PCR基因扩增仪(杭州博日科技股份有限公司);QuantStudio 3荧光定量PCR仪(Thermo公司);alliance e2695高效液相色谱仪(Waters公司);Optilab示差折光仪(Wyatt公司);DAWN 18角度静态光散射仪(Wyatt公司);JEM-2010FEF场发射透射电子显微镜(JEOL公司);Elx808 酶标仪(BioTek公司);三羟甲基氨基甲烷(Tris, Angus Chemical Company);Bis-Tris propane(BTP, BBI);NaCl(天津市海光药业有限公司);Na2HPO4(天津市科密欧化学试剂有限公司);NaAC(四川金山制药有限公司);AAVpro Titration kit(for Real Time PCR)(TaKaRa公司);resDNASEQ Quantitative Human DNA Kit(Thermo公司);PrepSEQTMNucleic Acid Extraction Kit(Thermo公司);PrepSEQTMResidual DNA Samplle Perparation kit(Thermo公司);HEK宿主细胞蛋白检测试剂盒(Cygnus Technologies公司)。

1.2 方法

1.2.1 阴离子交换层析柱筛选

缓冲液配制:A液:20 mmol/L Tris, pH 9.0;B液:20 mmol/L Tris, 150 mmol/L NaCl, pH 9.0。使用直径约16 mm柱管,对SOURCE 30Q、Q ImpRes、NanoQ-30L、MC30-Q等4种阴离子层析填料进行装柱,高度均为0.8 cm,CIMQ为1 mL阴离子交换层析柱。层析过程:(1)平衡: 90%A液,10%B液,流速4 mL/min进行柱平衡;(2)上样:流速4 mL/min;(3)再平衡: 90%A液,10%B液,流速4 mL/min进行柱平衡;(4)洗脱:10%～100%B液,200个柱体积,进行离子强度线性梯度洗脱,流速4 mL/min;(5)清洗:2 mol/L NaCl,流速4 mL/min,进行柱清洗。根据病毒基因组(Vg)含量和实心载体比率检测结果,初步筛选出表现良好的阴离子交换层析柱。

1.2.2 CIMQ层析柱工艺优化

(1)纯化缓冲体系的筛选。使用UNICORN 7.6软件中的交互过程模型,采用全因子混合设计方案,根据不同缓冲体系,设计方案包含2个中心点(实验编号7、8),8个实验,筛选出重要的影响因素,实验方案见表1。表1中缓冲体系的配制:Na2HPO4缓冲体系A液:10 mmol/L BTP, 5 mmol/L Na2HPO4, B液:10 mmol/L BTP, 65 mmol/L Na2HPO4;NaAC缓冲体系A液:10 mmol/L BTP, 5 mmol/L NaAC, B液:10 mmol/L BTP, 185 mmol/L NaAC;NaCl缓冲体系A液:10 mmol/L BTP, 5 mmol/L NaCl, B液:10 mmol/L BTP, 185 mmol/L NaCl。所有缓冲体系按照表1调节至所需pH。层析过程:使用平衡液90%A液,10%B液进行柱平衡,样品上样流速2 mL/min,平衡后使用3%～100%B液, 200个柱体积,进行离子强度线性梯度洗脱,流速4 mL/min,使用2 mol/L NaCl,流速4 mL/min进行柱清洗。

表1 全因子混合设计方案及实验结果Table 1 Full factorial mixed design scheme and experimental results

基于峰宽和峰距,根据公式分辨率RS=2(V2-V1)/(W1+W2)计算病毒空颗粒和实心载体峰的分辨率。其中,V1、V2分别为病毒空颗粒和实心载体洗脱峰最高点对应的体积;W1、W2为相邻两峰的峰宽。以病毒空颗粒和实心载体峰的分辨率作为响应值,根据Mixed Logistic Regression(MLR)混合逻辑回归模型,分析预测合适的层析缓冲体系。

(2)目标峰收集范围优化。为提高分离效果,洗脱时将离子强度线性梯度调整为10%～60%B液。缓冲液配制:A1液:10 mmol/L BTP;B1液:10 mmol/L BTP, 50 mmol/L Na2HPO4;B2液:10 mmol/L BTP, 150 mmol/L NaAC。以上缓冲液pH值均为8.0。Na2HPO4缓冲体系层析过程:使用平衡液90%A1液, 10%B1液,流速4 mL/min进行柱平衡,样品上样流速2 mL/min,平衡后使用10%～60%B1液, 200个柱体积,进行离子强度线性梯度洗脱,流速4 mL/min,设置收集器0.8 mL/管收集目标峰,使用2 mol/L NaCl,流速4 mL/min进行柱清洗。针对NaAC缓冲体系使用相同过程进行层析。所收集目标峰根据峰面积UV260/UV280和实心载体比率检测结果确定最终收集范围。

(3)纯化缓冲液体系优化。缓冲液配制:A1液:10 mmol/L BTP;B1液:10 mmol/L BTP, 50 mmol/L Na2HPO4;B2液:10 mmol/L BTP, 150 mmol/L NaAC;A2液:20 mmol/L Tris;B3液:20 mmol/L Tris,50 mmol/L Na2HPO4。以上缓冲液pH值均为8.0。BTP、Na2HPO4缓冲体系层析过程:使用平衡液90%A1液,10%B1液进行柱平衡,样品上样流速2 mL/min,平衡后使用10%～60%B1液,200个柱体积,进行离子强度线性梯度洗脱,流速4 mL/min;BTP、NaAC缓冲体系,Tris、Na2HPO4缓冲体系使用相同的过程进行层析。

1.2.3 rAAV5 Vg含量检测、实心载体比率检测、杂质残留检测以及电镜观察

纯化后的样品用DNase I消化去除宿主细胞核酸(HCD)残留和质粒转染相关的游离核酸,然后使用裂解液使病毒的衣壳蛋白变性,完成简单的目的病毒基因组提取后,利用qPCR对病毒基因组进行定量。实心载体比率通过高效液相色谱系统,采用CIMac AAV分析柱来定量AAV实心载体比率,或运用尺寸排阻色谱(SEC)与多角度散射(MALS)相结合,检测rAAV实心载体比率。HCD残留和质粒DNA(pDNA)残留检测,从纯化后的样品中提取残留DNA,使用相应的引物,采用qPCR技术检测HCD和pDNA。宿主细胞蛋白(HCP)是使用双抗体夹心法测定HEK293宿主细胞中蛋白残留水平。最后利用透射电镜观察纯化后rAAV病毒的形态和颗粒完整性。

2 结果与分析

2.1 阴离子交换层析柱筛选

rAAV5实心载体衣壳内含有完整的病毒载体基因组,而病毒空颗粒衣壳内缺乏病毒基因组,两者之间的电荷差异微弱,需选择分辨率相对较高的,填料粒径相对较小(约30 μm)的填料,或者选择CIMQ整体柱(通道孔径约6 μm),进行阴离子交换层析柱的筛选。实心载体因含有完整的病毒载体基因组,在纯化图谱中表现出相对较高的UV260紫外吸收峰,而病毒空颗粒在纯化图谱中会显示相对较高的衣壳蛋白UV280吸收峰。基于两者在纯化图谱中的紫外吸收峰差异,如图1所示,当UV260UV280时,收集实心载体(洗脱2)样品。层析图谱,CIMQ层析柱具有较好分离病毒空颗粒与实心载体的效果[图1(e)]。将收集的样品进行Vg和实心载体比率检测(HPLC法),检测结果见表2。结果显示,使用4种阴离子填料进行离子强度线性梯度洗脱所收集的实心载体洗脱液中,实心载体比率相对较低,不能有效分离病毒空颗粒与实心载体,这与图1(a)～(d)的结果是一致的。相比之下,CIMQ层析柱分离rAAV5空颗粒和实心载体的效果相对较好,实心载体比率最高。

(a) SOURCE 30Q;(b) Q ImpRes;(c) NanoQ-30L;(d) MC30-Q;(e)CIMQ monolithic chromatography columns。图1 阴离子交换层析离子强度线性梯度洗脱层析图谱Figure 1 Linear gradient elution chromatography profile of ion intensity for anion exchange chromatography

表2 层析样品Vg回收率和实心载体比率检测结果Table 2 Chromatography sample Vg recovery and vector capsids proportion test results

2.2 CIMQ层析柱工艺优化

2.2.1 纯化缓冲体系筛选

为进一步提高CIMQ层析柱的回收率和实心载体比率,需对纯化缓冲体系进行筛选,使用软件进行交互过程模型中的全因子混合方案设计,实验结束后,根据公式计算不同缓冲体系纯化图谱中,实心载体和病毒空颗粒洗脱峰的分辨率Rs,将分辨率Rs作为响应值,实验方案及结果如表1,中心点(实验编号7、8)的平行实验,分辨率差别很小,表明实验误差较小。同时,根据响应值结果,显示该模型R2(拟合度衡量标准>0.75)为0.986,Q2(模型预测能力>0.5)为0.895,模型效度(标准>0.25,模型缺乏数据则低)为0.682,重现性(标准>0.75,比较重复点的变异和整体变异)为0.982,显示本模型中数据拟合程度较高,模型有较佳的预测能力。

图2纵坐标显示传递函数的系数,相对NaCl缓冲体系,Na2HPO4缓冲体系的系数是显著的,可以将Na2HPO4缓冲体系作为首选,pH为表1中缓冲体系的pH值,pH×Salt(Na2HPO4)的系数为负值,表示在选用Na2HPO4缓冲体系时,pH值相对越低,病毒空颗粒和实心载体的洗脱峰的分辨率越高;pH×Salt(NaAC)的系数为负值,表示pH值相对越低,洗脱峰的分辨率越高,而pH×Salt(NaCl) 的系数为正值,表示pH值相对越高,洗脱峰的分辨率越高。

图2 峰分辨率的相关系数Figure 2 Correlation coefficient of peak resolution

利用模型优化预测实验结果,pH最低值设置为8.0,pH最高值设置为10.0,选择不同的缓冲体系,洗脱峰分辨率最大值设置为1,峰分辨率最小值设置为0.5,分辨率目标值设定为0.6,预测优化结果见表3。根据预测结果,Na2HPO4缓冲体系pH 8.0～9.0、NaAC缓冲体系pH 8.0、NaCl缓冲体系pH 10.0时,洗脱峰的预测分辨率相对较高。但是,NaCl缓冲体系的pH相对较高,可能会破坏病毒载体的结构,因此,选择Na2HPO4缓冲体系和NaAC缓冲体系来优化满足实心载体比率要求的洗脱峰收集范围。

表3 模型预测结果Table 3 Model prediction results

2.2.2 目标峰收集范围优化

基于筛选的纯化缓冲体系,配制BTP、Na2HPO4,pH 8.0和BTP、NaAC,pH 8.0缓冲体系进行实验,确定满足实心载体比率要求的目标峰收集范围。使用AKTA avant 150层析系统的收集器收集目标峰,病毒空颗粒的紫外吸收峰先出现,当UV260>UV280时收集实心载体目标峰,0.8 mL/管收集,直到紫外吸收曲线UV260和UV280出现交叉时停止收集。经SEC-MALS检测,结果见表4,在Na2HPO4和NaAC两种缓冲体系中,当峰面积UV260/UV280比值大于1.15时,实心载体比率大于75%,考虑到临床产品要求实心载体比率需大于70%,以及生产工艺的便捷性,可以从实心载体洗脱峰UV260和UV280紫外吸收交叉点开始收集,即当UV260>UV280时,立即收集样品,而洗脱峰尾部CIMQ洗脱7[图3(a)], CIMQ洗脱6[图3(b)]的实心载体比率均大于90%,直到紫外吸收曲线UV260和UV280出现交叉时,停止收集样品。即洗脱时收集紫外吸收值UV260/UV280的比值大于1的部分。

表4 实心载体比率检测结果Table 4 Vector capsids proportion test results

2.2.3 纯化缓冲液体系优化

采用2.2.2收集方式,针对BTP、Na2HPO4缓冲体系,BTP、NaAC缓冲体系和Tris、Na2HPO4缓冲液体系,在连续线性梯度下进行洗脱,评估实验的回收率、实心载体比率和各种残留检测是否符合预期。根据层析图谱(图4),可以观察到3种缓冲液体系分离病毒空颗粒与实心载体的效果相近,这与表5所示的实心载体比率结果一致,均达到80%左右。对其过程样品进行qPCR分析,结果见表5,使用BTP、Na2HPO4缓冲液体系的实心载体回收率达到57%,使用BTP、NaAC缓冲液体系的回收率达到62%,使用Tris、Na2HPO4缓冲液体系的回收率相对最高,达到73%。对其过程样品进行HCD、HCP、pDNA检测,结果见表6,显示3种缓冲液体系的洗脱样品各项指标均符合质量要求。因此,综合简便的收集方式和较高的Vg回收率,采用收集洗脱峰紫外吸收值UV260/UV280比值大于1的方式收集样品,选用Tris、Na2HPO4、pH 8.0缓冲体系,作为CIMQ层析柱纯化的缓冲体系。

(a) 10 mmol/L BTP, 50 mmol/L Na2HPO4 buffer;(b) 10 mmol/L BTP, 150 mmol/L NaAC buffer;(c) 20 mmol/L Tris, 50 mmol/L Na2HPO4 buffer。图4 层析柱层析缓冲体系优化层析图谱Figure 4 Chromatographic chromatogram optimized for chromatographic column chromatography buffer system

表5 CIMQ层析柱层析过程样品qPCR分析Table 5 CIMQ chromatography column chromatography process sample qPCR analysis

表6 CIMQ层析柱层析样品残留检测结果Table 6 CIMQ chromatography column chromatography sample residue detection results

2.3 电镜分析

将纯化后的病毒样品经磷钨酸负染,透射电镜下可以观察到典型的rAAV5形态(图5),病毒颗粒呈球形,直径在20～26 nm,有明显的正二十面体衣壳结构,形态完整,大小均一,并且大部分均为实心载体(明亮的球形),少数为病毒空颗粒(带有深色斑点的球体,箭头所示)。

箭头所示为rAAV5空颗粒。图5 rAAV5电镜图Figure 5 Electron micrograph of rAAV5

3 讨论与结论

重组腺相关病毒(rAAV)作为治疗人类严重疾病的DNA传递载体,已显示出巨大的前景。rAAV载体由蛋白衣壳和包裹在衣壳内的治疗性DNA组成。rAAV三质粒转染系统会包装出大量不包含靶治疗基因的病毒颗粒[18]。一方面,过量的病毒空颗粒通过中和抗体(NABs)、细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)甚至模式识别受体(PRRs)对病毒粒子衣壳的免疫识别,降低了转导效率,影响有效治疗,甚至这些额外的抗原负载会增加免疫反应的风险;另一方面,病毒空颗粒可能使中和抗体饱和,保护功能性实心载体有效的感染目标细胞群,然而这就需要在功能性实心载体中精确地按比例混合经过序列修饰的、非受体结合的相同血清型的病毒空颗粒[19-20]。无论哪种情况,都需要在纯化工艺中去掉这些产品相关杂质,以满足临床产品质量要求和工业规模化生产条件。

然而,由于实心载体和病毒空颗粒两者在大小和表面电荷上的相似性,使病毒空颗粒的去除具有挑战性[21-23]。传统的氯化铯或碘克沙醇梯度超速离心(UC)法,可以有效分离实心载体和病毒空颗粒,然而这两种梯度对样品的承载能力均有限,影响rAAV纯化的规模放大[24]。Qu等[14]介绍了用阳离子交换树脂POROS 50HS和阴离子交换树脂Q-Sepharosexl,在醋酸钠和醋酸铵梯度下,实现AAV2空颗粒和实心载体分离,回收率达到74%,实心载体比率大于80%。Urabe等[25]使用三甲基硫酸铵梯度洗脱强阴离子Mini Q和POROS HQ柱,去除了90%以上的AAV1空颗粒。Kaludov等[26]使用弱阴离子POROS PI和强阴离子POROS HQ填料可以有效去除AAV2、AAV4和AAV5空颗粒,实心载体比率可达到90%以上,但是回收率相对低。Dickerson等[27]使用NaCl和MgCl2的组合进行CIMQ洗脱,在病毒空颗粒和实心载体洗脱峰之间获得了接近基线的分辨率,在保证AAV2回收率大于70%的同时,实心载体比率也大于90%。

AAV5最初是从人类临床样本中分离出来的AAV血清型,与其他从实验室腺病毒毒株分离出来的血清型同源性最低,具有与其他血清型载体不同的特征。研究旨在开发一种针对rAAV5的阴离子交换层析方法,通过阴离子交换层析分离病毒空颗粒和实心载体。采用阴离子交换层析线性梯度洗脱,当pH值大于等电点时,病毒空颗粒带负电荷,病毒空颗粒的电负性小于实心载体,随着盐浓度的增加,病毒空颗粒将比实心载体更早被洗脱下来。病毒空颗粒和实心载体的电荷差别极小,两者的洗脱溶液电导差别也极小(甚至小于3.0 mS/cm),实际生产过程中洗脱条件容易受到环境的温度,称量的误差,不同仪器紫外检测器配置等因素的影响。在rAAV5的空颗粒与实心载体的分离上,可能微小的变化就会影响分离效果,采用线性梯度洗脱时,外界因素可能导致洗脱峰向左或者向右偏移,但不会影响病毒空颗粒与实心载体的分离,并且线性梯度还可以保证更好的重现性,其简单,易于扩大规模。

研究首先通过不同的阴离子交换层析柱对亲和层析捕获的rAAV5样品在相同缓冲液条件下进行了离子强度线性梯度洗脱,结果显示基于对流相互作用介质的CIMQ层析柱[22-23]分离病毒空颗粒和实心载体有更好的效果,洗脱液回收率相对较高,实心载体比率高于其他4种阴离子填料。筛选出层析柱后,对该层析柱进行了缓冲体系筛选,收集方式以及缓冲液体系的优化,优化后采用洗脱时收集紫外吸收值UV260/UV280的比值大于1部分,回收率达到73%,实心载体比率达到80.3%。

综上所述,本研究通过对rAAV5阴离子交换层析过程进行优化,所获得的病毒颗粒实心载体比率和杂质符合质量要求,回收率相对较高,该方法有望应用于临床级rAAV5基因治疗产品的规模化生产,为rAAV5载体大量制备提供了一种方法。