TRPM2基因敲除小鼠的建立与鉴定

时间：2024-08-31

王存连, 李龙飞, 张瑞华, 徐明举, 徐彤

(河北北方学院动物科技学院, 张家口 075000)

TRPM2(transient receptor potential melastatin-2)是瞬时受体电位超家族中M亚家族成员之一[1],作为氧化应激敏感性传感器,TRPM2介导氧化应激引起的细胞内Ca2+浓度升高,参与多种细胞的生理/病理过程[2-3]。因此,TRPM2可作为氧化应激相关性疾病潜在治疗靶点。抑制内源性TRPM2的表达和功能,能有效缓解H2O2作用下氧化应激导致的血管内皮细胞损伤[4]。研究发现,H2O2可以通过TRPM2活化钙依赖性络氨酸激酶2(Pyk2)引起Ca2+内流,进而通过RAS信号途径激活Erk信号通路,证实TRPM2离子通道是活性氧类自由基进一步引起炎性反应的重要级联信号通路之一。同时,TRPM2通道介导的Ca2+内流可以调控氧化物诱导趋化因子产生的信号级联反应,反馈性增加嗜中性粒细胞对内皮细胞的黏附和ROS的产生,进而导致内皮细胞炎症和损伤加重,血管渗出性增强[5],表明TRPM2离子通道可能是氧化应激导致血管内皮细胞进一步损伤的重要途径之一。

CRISPR/Cas9技术作为第三代基因组定点编辑技术,凭借成本低、操作方便、效率高等优点在疾病治疗、基因工程、基础研究方面广泛应用[6-8]。本研究利用CRISPR/Cas9技术建立TRPM2基因敲除小鼠模型,为进一步开展TRPM2基因及其表达产物的生物功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

4周龄SPF级雌性C57BL/6J小鼠30只,体重约15 g;10周龄SPF级雄性 C57BL/6J 小鼠2只,10周龄ICR结扎雄鼠和ICR母鼠各15只,体重约65 g,均购自上海南方模式生物科技股份有限公司[SCXK(沪)2017-0012],饲养于河北北方学院实验动物中心,期间自由采食饮水,昼夜各半循环照明,湿度恒定,温度控制在22 ℃～25 ℃。

1.1.2 主要试剂

MEGA shortscriptTMT7 Transcription Kit、DNA Marker(美国ThermoFisher);鼠尾DNA提取试剂盒、逆转录试剂盒(Takara公司);2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)(北京全式金生物技术有限公司);BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、PVDF膜、ECL Plus超敏发光液(上海碧云天生物技术公司);孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)(南京爱贝生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA与Cas9 mRNA的获得

选择Ensembl数据库中的Trpm2-203转录本作为参考,该转录本共包含34个外显子。将Trpm2-203转录本的第3～24个外显子作为敲除区域。根据内含子2和内含子24的序列,利用crispr.mit.edu软件设计sgRNA序列并由公司进行合成。将T7-Cas9载体酶切线性化后,在 T7 启动子的作用下体外转录为Cas9 mRNA。

1.2.2 显微注射、胚胎移植及子代工程鼠基因序列分析

雌性C57BL/6J小鼠腹腔分别注射10 U PMSG及hCG,注射间隔时间48 h。收集雌鼠的输卵管膨大部和雄鼠的附睾,分别取出卵子和精子。待精子在获能液中获能后,取液体边缘精子滴加入短暂培养的卵细胞中,体外受精3～4 h。将sgRNA和Cas9 mRNA通过显微注射到C57BL /6J 的受精卵中,挑选注射后状态良好的受精卵,移植到假孕母鼠的输卵管内,待其自然生下F0代小鼠。剪取经原核注射产生的1周龄首建鼠的尾巴,提取基因组DNA,进行PCR扩增,上游引物:5′-GAGCGGGTTGCAGTGTCCTTTGA-3′,下游引物:5′-TCTGCTCTTTGCCCCTTCCTCTTA-3′。构建20 μL PCR扩增体系,扩增程序:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性20 s,63 ℃退火20 s,72 ℃延伸2 min,35个循环;72 ℃再延伸2 min,4 ℃循环。对扩增出的PCR产物进行胶回收并与T载体连接,后续进行转化、摇菌、测序,将测序结果与 C57BL /6J小鼠基因目的序列比对,分析靶点序列缺失情况。

1.2.3 基因敲除小鼠繁殖、基因序列分析及基因型鉴定

将显微注射获得的阳性F0代小鼠分别与野生型的 C57BL /6J 交配,对交配获得的F1代小鼠进行基因序列分析并分别建系,分析方法同上。

1.2.4 TRPM2基因敲除RNA水平验证

小鼠眼内眦取抗凝血0.1 mL,提取RNA,反转录,取反转录的反应液2 μL为模板,进行qRT-PCR反应,上游引物:5′-GATCCAAAGAAACACGTCCAAG-3′,下游引物:5′-CATGAGCTGGTAGATGACACTG-3′。构建qRT-PCR扩增体系,扩增程序:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性15 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸15 s,40个循环;95 ℃再延伸15 s,60 ℃ 1 min进行熔解曲线扩增。

1.2.5 TRPM2基因敲除蛋白水平验证

取小鼠肺组织,按比例加入裂解液进行匀浆,匀浆后置于冰上裂解30 min,10 000 r/min 4 ℃离心10 min,收集上清液。用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量,通过蛋白印迹法进行TRPM2蛋白表达水平测定,用Quantity One Chemi DocXRS图像采集系统及分析软件对蛋白条带进行分析处理,蛋白含量用目的条带校正容积/GAPDH校正容积表示。

2 结果与分析

2.1 Cas9和gRNA体外转录

根据TRPM2基因的intron2和intron24序列,利用crispr.mit.edu软件设计sgRNA序列,详见表1。单酶切T7-Cas9载体使其线性化后,在 T7 启动子的作用下体外转录为Cas mRNA,1%琼脂糖凝胶电泳检测如图1所示。

(a)1、2为sgRNA1,3、4为sgRNA2,5为DNA Marker;(b)1为T7-Cas9环状载体,2为T7-Cas9线性化载体,3为Cas9 mRNA,4为DNA Marker。图1 体外转录Cas9、sgRNA电泳Figure 1 Electrophoresis results of cas9 and sgRNA transcribed in vitro

表1 Intron2、intron24序列及sgRNA引物序列Table 1 Intron2, intron24 sequences and sgRNA primer sequences

2.2 阳性F0代小鼠PCR测序鉴定

F0代小鼠TRPM2基因敲除构建策略如图2所示。对F0代小鼠PCR产物进行测序,获得3只阳性小鼠,分别为5#、6#和13#,其基因组序列详见表2。由表2可知,与野生型(WT)小鼠基因序列相比,F0阳性小鼠分别出现44 109、44 110、44 111和44 411(TA)碱基的明显缺失,表明F0代小鼠成功构建。

图2 TRPM2基因敲除构建策略Figure 2 Construction strategy of TRPM2 gene knockout

表2 F0代小鼠TRPM2基因序列突变情况Table 2 TRPM2 gene sequence mutation of F0 generation mice

2.3 F1代小鼠获得、TRPM2基因序列分析及基因型鉴定

2.3.1 F1代小鼠TRPM2基因信息

选取阳性F0代小鼠5#、6#和13#号分别与野生型C57BL/6J小鼠交配,获得的F1代杂合子小鼠有4种类型,分别为敲除类型1,缺失44 109个碱基对;敲除类型2,缺失44 110个碱基对;敲除类型3,缺失44 111个碱基对;敲除类型4,缺失44 111(TA)个碱基对。鉴定方法同2.2 F0代小鼠鉴定,F1代杂合子小鼠信息及TRPM2基因序列突变情况见表3。通过基因测序比对结果表明(表2),F1代4种敲除类型的阳性小鼠,TRPM2基因部分编码区和重要结构域缺失,从而造成其基因功能缺失。

表3 F1代阳性小鼠TRPM2基因信息Table 3 TRPM2 gene information of F1 positive mice

2.3.2 不同突变类型F1代小鼠基因型鉴定

提取小鼠基因组DNA,使用引物对(I:5′-AGCCTGGTCAACTGATTTCTAT-3′和II:5′-AGGCTGCTATTGCTTCGTC-3′);III:5′-TTCACTGGTCTGGGTTCTTATTCA-3′和IV:5′-GACTCGCCAAACTATTCACTCACA-3′)分别扩增,基因型鉴定策略及PCR鉴定结果见图3。鉴定依据为野生型:(I,II)扩增出600 bp条带,(III,IV)无小条带;杂合子:(I,II)扩增出600 bp条带,(III,IV)扩增出小条带400 bp;纯合子:(I,II)无条带,(III,IV)扩增出小条带400 bp。

(a)He为引物I和II扩增产物;(b) He为引物III和IV扩增产物。M为DNA Marker。图3 F1代小鼠基因型鉴定策略及鉴定Figure 3 Genotype identification strategy and results of F1 generation mice

2.4 TRPM2基因敲除RNA水平验证

qRT-PCR分析结果显示(图4),TRPM2基因敲除纯合子小鼠血液中mRNA相对值为零,表明该基因已被敲除,没有表达。

WT为野生型小鼠;HE为TRPM2基因敲除杂合子小鼠;HO为TRPM2基因敲除纯合子小鼠。图4 F1代小鼠血液TRPM2 mRNA表达水平Figure 4 Expression level of TRPM2 mRNA in blood of F1 generation mice

2.5 蛋白水平基因敲除效果验证

Western Blot检测结果显示(图5),WT小鼠肺组织内在分子质量为171 ku附近出现明显的条带;而TRPM2-/-基因敲除纯合小鼠肺组织内TRPM2蛋白也有少量表达,但是与野生型相比具有明显差异(P<0.01)。

WT为野生型小鼠;TRPM2-/-为基因敲除纯合子小鼠。大写字母不同表示差异极显著(P <0.01)。图5 F1代小鼠TRPM2蛋白表达水平Figure 5 TRPM2 protein expression level of F1 generation mice

3 讨论

瞬时受体电位(TRP)超家族是一类非选择性阳离子通道,根据氨基酸序列的同源性可以将其分为7个亚家族,分别是TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP、TRPML和TRPN,其中M亚家族成员在细胞增殖和存活方面具有重要作用[9-10]。TRPM2是TRPM亚家族成员之一,广泛分布于脑、免疫系统、肺、肾及心脏等多种组织器官中,是氧化应激敏感性的效应器,能够被ROS、H2O2、Ca2+以及其C末端的NudT9-H与ADP-核糖(ADPR)相结合所激活[11]。研究报道,TRPM2在氧化应激相关的细胞死亡中发挥重要作用,病理条件下TRPM2的激活促进了炎症的发生和组织损伤[12]。TRPM2作为氧化应激传感器,介导氧化应激引起的细胞内Ca2+浓度升高,并参与多种细胞的生理、病理过程,是治疗氧化应激相关性疾病潜在的靶点[13-14]。目前,越来越多的研究人员通过建立基因敲除动物模型来研究基因的生物学功能,基因敲除是证明基因功能不可缺少的逻辑环节,也是最直接有效的方法之一[15-17]。

CRISPR/Cas9技术是目前最精准、最高效的基因编辑工具,为建立基因敲除动物模型提供了更直接的基因敲除方式。传统的同源重组方法在进行特定基因座的基因修饰时需要在体细胞中进行同源重组后再通过细胞核移植才能实现基因修饰,该方法的操作难度大、效率低,严重阻碍了基因修饰在特定基因的生物学功能研究及生理和病理动物模型方面的应用。CRISPR/Cas9系统通过RNA引导核酸内切酶在特定基因靶点进行基因修饰,相较传统的基因编辑技术,其不需要同源重组和胚胎干细胞或成纤维细胞等中间介质,可以直接在受精卵中应用。此外,它还可以在细胞或胚胎中进行更高效的同源重组从而实现特定位点的DNA序列敲入[18]。CRISPR/Cas9技术因其操作便捷、成本低、靶向效率高等诸多优点在基因功能研究、疾病治疗和制药等方面广泛应用。Li等[19]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将H7N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)基因敲入HVT基因中,构建了一种重组rHVT-H7HA多价疫苗载体,可以实现对H7N1亚型禽流感病毒和马立克病病毒感染雏鸡的双重保护。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术使HYAL2基因功能缺失后能有效防治绵羊肺腺癌综合征[20]。

在本研究中,利用CRISPR/Cas9技术,通过非同源重组修复引入突变的方式,分别针对小鼠TRPM2基因的第2内含子和第24内含子设计sgRNA敲除引物并进行体外合成,通过显微注射的方式将体外合成的sgRNA以及Cas9 mRNA导入小鼠受精卵中,产生F0代阳性小鼠3只,分别为5#、6#和13#,这3只小鼠中TRPM2基因蛋白读码框移码,功能缺失,表明成功建立了TRPM2基因功能缺失的C57BL/6J小鼠模型。将其分别与野生型C57BL/6J小鼠交配,获得的F1代杂合子小鼠有4种类型,分别为敲除类型1,缺失44 109个碱基对;敲除类型2,缺失44 110个碱基对;敲除类型3,缺失44 111个碱基对;敲除类型4,缺失44111(TA)个碱基对。经过基因鉴定后确认来自同一只F0小鼠的F1自交,产生约25%的纯合TRPM2基因敲除小鼠。通过qRT-PCR和Western Blot进行mRNA和蛋白表达鉴定,结果显示敲除区域TRPM2基因完全缺失,TRPM2 mRNA和蛋白表达量降低。尽管qRT-PCR检测血液组织几乎没有mRNA表达,但是肺组织内仍有少量蛋白表达,这可能是由于生物机体是一个复杂的网络系统,某个信号通路可能由多种途径调控,这种现象在其他的基因敲除动物模型也相应存在,上述结果表明成功建立了TRPM2基因敲除小鼠。利用本试验建立的基因敲除小鼠模型,可深入探讨TRPM2基因在流感病毒感染哺乳动物肺损伤中的生物学机制,尤其是氧化应激导致肺微血管内皮细胞损伤作用机制[21-23],为进一步揭示流感病毒致病机制,开发有效治疗药物提供有价值的模式动物。