巩固递进式动物细胞原代培养实验教学的构建与实践

潘 倩, 李浩琪, 刘津邑, 胡伯琦, 杨慧坤, 陈 汪

(四川大学华西基础医学与法医学院, 成都 610041)

动物细胞培养是生命科学领域常用的技术之一,应用广泛,是生命科学专业学生应掌握的一门实验技能[1-2]。原代培养是细胞从动物体分离后至第一次传代前的培养阶段,它是动物细胞培养第一个也是最关键的阶段,是建立各种细胞系的第一步[3],因此,动物细胞原代培养是相关专业本科生应熟悉和掌握的最基本技术。

相较传代培养等其他细胞培养技术,动物细胞原代培养存在操作步骤多、污染风险高、技术难度大等问题[4-6]。根据四川大学华西医学基础国家级实验教学示范中心的经验,在以往的实验教学中,学生只有一次机会进行原代培养,实验成功率一直比较低,影响在此基础上后续实验的开展。如果只是对原有实验项目进行简单重复练习(即循环式教学),在有限的课时内,课堂效率明显不高,效果也不显著。除此之外,以往的实验教学基本以老师为主导,注重实验技术向学生的单向输出,往往忽略了学生能力素质的锻炼[7-8]。

为解决上述问题,该研究围绕“以学为中心”,以促进学生知识技能掌握、能力素质提高为出发点[9-10],融合实验操作与自主实验方案设计,构建了一种动物细胞原代培养的巩固递进式实验教学模式并付诸实践。该巩固递进式实验教学,对重要且应用广泛的无菌技术、酶消法细胞原代培养技术进行了多次巩固练习,并随实验项目的依次开展,逐步引入植块法细胞原代培养、免疫细胞化学鉴定对细胞原代培养实验进行递进深化,还适时安排学生进行先易后难的自主实验方案设计,实验的扩展性、深入性、综合性、设计性等均相应递增,以此提高实验成功率和课堂效率,切实促进实验教学质量的提高,加快一流人才的培养[11]。

1 教学模式构建

1.1 教学模式

该巩固递进式实验教学共包含3项综合性/设计性实验项目,涵盖无菌技术、酶消法原代培养、植块法原代培养、细胞形态观察、细胞鉴定等5大实验技术,对无菌技术、酶消法原代培养、细胞形态观察巩固练习3次,引入递进深化实验2项(植块法原代培养、细胞鉴定),开展自主实验方案设计2次,具体情况见图1。

下划线为教学重点;*为教学难点。图1 巩固递进式动物细胞原代培养实验教学具体情况Figure 1 Consolidated progressive experimental teaching of animal-cell primary culture

1.2 实验项目

1.2.1 小鼠肾细胞原代培养——酶消法

主要包括动物处死、消毒、肾脏取材、漂洗、剪切、胰酶消化、细胞解离、过滤、接种、培养等步骤,组织/培养液接种浓度为25～30 mg/mL。酶消法得到的肾细胞原代培养物9 d后基本长满培养孔底壁,倒置相差显微镜下观察可见原代培养物混有多种细胞,其中主要是上皮样细胞和成纤维样细胞。

1.2.2 两种小鼠肾细胞原代培养方法的比较——酶消法和植块法

主要步骤同1.2.1,得到肾组织小块后将其一分为二,一份用于酶消法原代培养(自主设计实验方案,主要参数包括酶的作用浓度、作用条件、作用时间等),另一份直接规则排布在底壁后常规培养,植块间距0.3～0.5 cm。植块接种后培养4 d可见较多细胞迁出;在上述植块接种密度下培养9 d细胞可基本长满培养孔底壁。植块法原代培养物同样为多种细胞混合物,其中上皮样细胞和成纤维样细胞仍为主要类型。

1.2.3 小鼠肾细胞原代培养物中上皮细胞的鉴定

采用1.2.1的方法培养细胞。学生自主设计肾上皮细胞的鉴定方案。常规鉴定步骤主要包括漂洗、固定、灭活内源性过氧化物酶、封闭、一抗/二抗孵育、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素孵育、DAB显色、苏木素染色等[12-13]。经角蛋白18免疫细胞化学检测,在倒置相差显微镜下可见小鼠肾原代培养物中有较多细胞胞质内有分布不均、强弱不等的棕褐色颗粒,显示角蛋白18阳性,证明小鼠肾原代培养物中确实存在较多的上皮细胞。

1.3 教学安排

该巩固递进式实验教学的学时安排见表1,各实验项目均由同一位老师在相同的教学条件下授课。可将学生分组,2～3人为1个小组,小组内成员协调分工与合作,共同完成实验任务[14]。

表1 巩固递进式动物细胞原代培养实验教学的学时安排Table 1 Consolidated progressive experimental teaching schedule of animal-cell primary culture

1.4 考核评价

充分贯彻全过程考核和非标准答案考试,成绩构成[15-16]见表2,其中实验操作和自主实验方案设计作为平时成绩占总成绩的80%。

表2 巩固递进式动物细胞原代培养实验教学的考核评价表Table 2 Consolidated progressive experimental teaching assessment of animal-cell primary culture

2 教学实践

2.1 实验群体

以四川大学2017级基础医学专业本科生46人为实验群体。

2.2 教学效果评估内容

重点通过各小组实验结果的质量和问卷调查中的学生评价2个方面来考察教学效果。每次完成相应实验项目的教学后,均及时统计各小组的实验结果,并面向学生进行教学效果的问卷调查,调查问卷的填写按照不记名、自愿的原则,以确保调查的准确可靠。对回收的问卷进行严格筛选,剔除缺失项大于1的问卷。

2.3 统计学处理

统计学处理采用SPSS 19.0完成,应用卡方检验比较各小组实验结果的质量差异以及问卷调查中的学生评价差异。

2.4 教学效果与不足

2.4.1 各小组酶消法小鼠肾细胞原代培养的实验结果质量

在实验项目一、二、三的依次开展中,学生对酶消法小鼠肾细胞原代培养进行了巩固递进式学习(图1),各小组的实验结果质量情况如表3所示。经卡方分割两两比较可知,实验项目三的结果优秀率与实验项目一显著不同(P<0.05),表明随着巩固递进式实验教学的开展,学生实验结果的优秀率得到了较大提高,学生的实验技能水平有了相应提升,巩固递进式实验教学取得了明显效果,这也符合教学预期。

表3 各小组酶消法小鼠肾细胞原代培养的实验结果质量(n=14)Table 3 Student groups’ experiment results of mouse primary kidney cell culture by enzymatic disaggregation(n=14)

2.4.2 调查基本情况

向学生发放调查问卷共计3次(分别在完成实验项目一、实验项目二和实验项目三的教学后进行),每次46份,调查问卷的回收情况如图2所示。其中实验项目一、二的问卷回收率高,均在90%以上,与之相比,实验项目三的问卷回收率较低,这可能和多次进行问卷调查引起部分学生产生消极态度有关,这提示今后在问卷的编制和调查的开展方面应提高效率,尽量一次性完成。为保证数据的准确可靠,教研组坚持问卷填写自愿原则,并不对未填写的学生做强制要求;虽然实验项目三的问卷回收率没有实验项目一、二那么高,但也在70%以上,同样可以反映大多数学生的学习效果。

图2 学生评价教学效果的调查问卷回收情况Figure 2 Recovery of questionnaires about teaching effect evaluated by students

2.4.3 调查问卷中的学生评价

调查内容与统计结果见表4,3个实验项目的“非常/基本满意”评价均在90%以上,表明该巩固递进式实验教学在学生中的满意度很高,能被学生广泛接受。

表4 学生评价教学效果的问卷调查结果Table 4 Survey results of teaching effect evaluated by students

在能力素质培养方面,通过该巩固递进式实验教学,学生的实践、合作、分析和解决问题的能力均得到很好的锻炼(比例均在50%以上),其中,合作能力随实验项目一、二、三的依次开展呈递降趋势,且实验项目二、三与实验项目一有统计学差异,这表明随着实验的巩固递进开展,在合作学习的基础上,学生的自主独立性得到切实加强。同时随实验项目一、二、三依次开展,学生探究、创新和科学思辨能力均有逐步提升的趋势,尤其是创新能力,实验项目三与实验项目一相比有统计学差异,说明该巩固递进式实验教学在提升学生创新能力方面效果显著。另外,该巩固递进式实验教学在培养学生的创新、科学思辨、应用、总结等能力方面还需要进一步加强(比例均在50%以下),提示应在今后的教学设计中强化相关内容的训练。

3 总结

该巩固递进式实验教学,遵循“以学为中心”的教育理念,综合运用合作学习、自主学习等多项教学策略,依次开展扩展性、深入性、综合性、设计性等相应递增的实验项目,有效提高学生的实验成功率,强化学生实践、合作、分析、解决问题的能力,提高了探究、创新等素质。

该巩固递进式实验教学制定了详细的操作流程,并经过实验教师反复验证,实验结果重复性高。实验开展所需的主要试剂耗材和仪器设备,在开设有细胞培养实验课程的高校实验室中均较为常见,因此可操作性强。考虑到相关实验项目的综合性和设计性均较强,该巩固递进式实验教学比较适合在高年级学生中开展。在实际应用中,各单位可根据自身的课程安排,结合实验室日常开放,在原有实验项目的基础上引入试行。