高内涵模型检测细胞焦亡用于抗炎药物筛选的实验教学设计

阮班锋, 陈刘赠, 吴 克, 张 敏

(合肥学院生物食品与环境学院, 合肥 230601)

如何在本科教育中体现创新发展的理念,培养具有创新精神和创新能力的大学生是当前教学改革的核心问题。细胞生物学是一门理论知识与实验技术并重的学科,尤其是细胞生物学实验技术,是推动生命科学、 医学、药学等相关研究领域蓬勃发展的关键核心技术之一[1-2]。细胞焦亡(Pyroptosis)是一种新发现的细胞死亡形式, 是一种高度促炎性的细胞程序性死亡[3]。目前,激活 caspase-1 和 caspase-4、5、11 所引发的细胞焦亡,被认为是宿主抵抗感染的辅助免疫防御机制。此外,在炎性肠病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、痛风性关节炎等人的自身炎症性疾病过程中也发现细胞焦亡的参与[4]。NLRP3炎症小体是一种多聚蛋白复合物,活化的炎症小体介导IL-1β和IL-18的分泌,同时导致细胞焦亡[5]。研究发现NLRP3炎症小体参与机体的多种病理过程,与多种炎性疾病的发生发展密切相关。因此,通过细胞焦亡的检测筛选NLRP3炎症小体活化抑制剂在抗炎药物研发中具有重要意义[6]。

荧光染料PI(碘化丙啶)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂,它是一种溴化乙啶的类似物,在嵌入双链DNA后显红色荧光[7]。Hoechst 33342可以直接透过细胞膜对活细胞和死细胞的DNA染色(蓝色荧光),由此可以通过荧光区分正常细胞与焦亡细胞[8]。利用高内涵计数不同条件下PI染色的焦亡细胞总数和Hoechst 33342染色的细胞总数,通过两者的比值(焦亡率)反映化合物的生物学活性[9]。

目前NLRP3炎症小体抑制剂的筛选主要是利用ELISA试剂盒检测化合物对IL-1β分泌的抑制作用,但ELISA试剂盒价格昂贵、操作复杂,并且实验重复性较差,同时本科生创新创业项目受实验场地、实验仪器和经费等限制。因此,结合长期科研积累与教学工作经验,课题组专门为国家级大学生创新创业训练计划设计了基于高内涵筛选模型检测细胞焦亡从而筛选NLRP3炎性小体抑制剂实验,通过对化合物库的筛选,寻找具有成药潜力的小分子化合物,使其具有创新创业潜力。

本实验选择NLRP3抑制剂冬凌草甲素(Oridonin)、MNS(3,4-Methylenedioxy-β-nitrostyrene) 为研究对象[10-11]。利用LPS/Nigericin诱导细胞焦亡,加入不同浓度的冬凌草甲素与3,4-亚甲二氧基-β-硝基苯乙烯,采用PI/Hoechst 33342 染色焦亡细胞与正常细胞,使用高内涵进行拍照并计数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

J774A.1细胞系购自中科院细胞库,DMEM高糖培养基与胎牛血清购自Hyclone公司,青霉素-链霉素购自碧云天生物公司,PI与Hoechst 33342试剂购自索莱宝公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞复苏与冻存

从中国科学院上海细胞库购入生长状态良好J774A.1小鼠腹腔巨噬细胞,J774A.1细胞用10%进口血清配制含1%青霉素与链霉素双抗的DMEM高糖培养基培养。细胞培养箱37 ℃、5% CO2。在细胞处理方面,一般2～3 d换一次液或是传一次代。显微镜下观察,当细胞生长的密度达到70%～80%且生长状态良好时,可以冻存。用移液器把细胞吹落,集中到15 mL离心管,1 500 r/min离心3 min,倒上清液,加冻存液重悬,转移至冻存管,封口膜封口,标记日期,短期储存放入-80 ℃冰箱,长期储存转移到液氮罐。J774A.1细胞进行处理时不能用胰酶消化,否则会引起细胞变异和分化。

1.2.2 高内涵模型的建立与NLRP3炎症小体体外造模

实验原理:NLRP3炎症小体激活会引发细胞焦亡,焦亡的细胞其细胞膜会被打孔产生孔洞。碘化丙啶(PI)对细胞核DNA进行染色,释放可被检测的红色荧光。活细胞的细胞膜有防御和屏障作用,PI无法穿过,但当焦亡细胞细胞膜破损有孔时,PI可以透过细胞膜对核染色。Hoechst 33342可以给细胞DNA染色,无论活细胞还是死细胞,并释放蓝色荧光。利用PI对焦亡细胞DNA进行染色,利用Hoechst 33342给所有细胞DNA染色,通过双染得到焦亡细胞占所有细胞的比例,即焦亡率。

实验步骤:取对数期的J774A.1细胞,每孔6×104～8×104万个细胞,将细胞接种在Corning 96孔板中,37 ℃培养箱孵育过夜。第二天,观察到细胞长满每个孔且不重叠时即可进行下一步实验。用浓度为1 μg/L的LPS进行刺激,刺激时间为4.5 h,加入提前配制好的不同浓度含化合物培养基共同孵育1 h,然后加入Nigericin(每孔终浓度为10 μmol/L)活化细胞1 h。最后加入PI/Hoechst 33342双染色试剂,摇床摇5 min,用高内涵进行上机检测。利用高内涵计算程序对拍出的染色照片进行批量数据处理,计算焦亡细胞占比得出焦亡率。

2 实验结果

2.1 NLRP3炎症小体筛选模型构建

实验结果表明,LPS/Nigericion能够明显诱导J774A.1细胞中NLRP3炎症小体的活化,导致细胞发生焦亡。在光学显微镜下,细胞经过诱导后变大。加入PI/Hoechst 33342 双染色试剂,能够明显发现所有细胞被染蓝色荧光,发生焦亡的细胞被染红色。利用高内涵能够计数不同荧光下的细胞数,通过计算红色荧光与蓝色荧光的细胞数比值,即可以得到化合物的抑制焦亡率(图 1)。

图1 高内涵筛选细胞焦亡模型的构建Figure 1 Construction of pyroptosis detection model based on high content screening

为了进一步检测模型的准确、稳定与可重复性,采用NLRP3炎症小体抑制剂冬凌草甲素(Oridonin)和3,4-亚甲二氧基-β-硝基苯乙烯(MNS)作为模型检测化合物用于本实验。化合物分别被设置成高低两种浓度,高浓度为10 μmol/L,低浓度为5 μmol/L;LPS刺激细胞4 h后加入化合物孵育1 h,接着加入活化剂Nigericin(10 μmol/L)刺激细胞30 min。结果表明,这两种化合物均能抑制NLRP3活化导致的细胞焦亡。冬凌草甲素能够浓度依赖性抑制细胞焦亡(图2)。利用高内涵分析,冬凌草甲素的细胞焦亡抑制率为95.23±5.45%(10 μmol/L)和65.18±6.12%(5 μmol/L);3,4-亚甲二氧基-β-硝基苯乙烯对细胞焦亡的抑制率为93.45±5.29%(10 μmol/L)和85.17±5.55%(5 μmol/L),见图 3。实验结果表明模型稳定、准确度高且具有良好的可操作性。

图2 冬凌草甲素抑制细胞焦亡Figure 2 The pyroptosis inhibition of Oridonin

***表示实验组与模型组相比,P <0.001。图3 冬凌草甲素和MNS的抑制细胞焦亡率Figure 3 The pyroptosis inhibition rate of Oridonin and MNS

3 讨论

3.1 教学设计

(1)课题设计。大学生创新实验应该设计巧妙、思路清晰并且能够紧跟前沿热点[12]。基于细胞水平的高内涵筛选技术可以实现多参数的同步检测,使在细胞水平全面评价活性化合物的生物学活性成为可能,并且大大降低了筛选成本,提高了药物筛选效率。基于高内涵构建一个以检测细胞焦亡为指标的筛选模型,克服了本科教学项目经费不足、大型设备限制的缺点。

(2)实验材料。大学生创新实验应该要求操作简单、实验成功率高,以培养学生的科研兴趣为主[13-14]。J774A.1细胞(小鼠腹腔巨噬细胞)是一种贴壁细胞,使用DMEM高糖培养基进行培养,培养条件简单,细胞生长速度快。在荧光显微镜镜下观察到细胞呈圆形透亮、分布均匀说明细胞生长状态很好,并且在实验过程细胞易吹散与传代,免去了消化、离心等步骤,减少实验误差大大提高了可操作性。

(3)体外造模。NLRP3炎症小体的体外造模方法有多种,不同的刺激因子诱导浓度和诱导时间不同。在本实验中,选择了效果最明显的LPS/Nigericin刺激细胞活化,同时让学生探索不同的诱导时间和诱导浓度对模型活化的影响,提高学生对实验的主动性与探索性,激发学生的科研热情,培养学生的创新能力。

(4)高内涵模型的建立。NLRP3炎症小体活化的检测方法有多种,主要包括ELISA检测IL-1β或是IL-18的分泌[15]、检测LDH(乳酸脱氢酶的分泌)[16]等,各种检测指标优缺点明显,均很难面向本科生大规模展开。依据NLRP3炎症小体活化导致细胞焦亡的理论,通过PI/ Hoechst 33342染色焦亡细胞与正常细胞,利用高内涵计数不同视野下的细胞数,成功构建了基于细胞焦亡的高内涵筛选模型。与传统的检测NLRP3炎症小体活化方法相比,该模型操作简单,实验成功率高且抑制剂不易脱靶;与高内涵搭配教学,加深学生对靶向NLRP3炎症小体开发治疗慢性炎症相关疾病药物这一前沿热点的理解,实验设计既有宽度也有深度,对学生创新能力和创业热情都有较大的提升。

3.2 教学组织

本科生参加大学生创新创业项目,最大的缺点就是很难有较长固定的时间,围绕一个实验开展系统的研究与实验[17]。教师首先针对研究课题,进行系统、全面的理论讲解与思路引导;对学生进行简单的仪器培训和细胞培养操作演示等,如果课程组有培养研究生的任务,那么研究生能够带动本科生更快适应各种操作[18]。实验开始前,必须让本科生完整理解整个实验流程,心中明确每一步的操作与意义;实验过程中可以积极给学生讲解实验中出现的现象代表着什么问题;实验结束后,学生应统一汇报展示,教师帮忙分析实验结果及出现的问题,让学生总结经验,为下一次实验做好准备。学生参与国家级大学生创新创业训练计划项目,激发了学生的科研兴趣,培养了学生创新意识,得到了学生的一致好评。

4 结论

在本科生参加国家级大学生创新创业训练计划过程中,以科研项目为依托,科研教学联动,是提升学生创新能力、培养创新型人才的重要措施。课程组针对国家级大学生创新创业训练计划设计了利用高内涵筛选模型检测细胞焦亡并用于筛选抗炎药物这一综合性细胞生物学实验。利用J774A.1细胞系,体外构建NLRP3炎症小体活化模型,利用PI/Hoechst 33342染色焦亡细胞与所有细胞,利用高内涵检测不同视野下焦亡细胞数与细胞总数,通过两者的比值确定化合物的抗细胞焦亡活性,评价化合物抗炎活性,让学生在掌握实验原理的同时,有更多操作和思考的空间,充分调动学生主观能动性。实验操作简单、结果直观,成本低且效率高,适用于大学生创新创业计划项目,后续可进一步推广为基础实验或综合性生物学实验项目。