不同类型牛血清对MDCK细胞培养效果研究

李自良， 王家敏， 赵彩红， 王美皓， 李 倬， 乔自林， 马忠仁

(1. 西北民族大学 生物医学研究中心 甘肃省动物细胞技术创新中心， 兰州 730030 2. 西北民族大学 生物医学研究中心 生物工程与技术国家民委重点实验室, 兰州 730030 3. 西北民族大学 生命科学与工程学院， 兰州 730030)

MDCK(Madin-Daby Canine Kidney, MDCK)细胞由Madin和Darby于1958年从美国Cocker Spaniel母曲架犬肾脏组织分离培育建立[1]。由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易变异，是公认的适于流感病毒复制的3种细胞系之一[2]。我国流感疫苗和禽流感疫苗生产主要采用鸡胚生产工艺，但鸡胚生产工艺存在生产周期长、操作繁琐、工作量大、易污染等诸多缺陷，如遇禽流感大规模暴发，鸡胚的供应存在很大问题[3-5]。若采用传代细胞生产疫苗的工艺，将不受鸡胚等天然因素的限制，且生产周期短，工艺简单，如遇流感暴发会快速反应，短时间内可提供大量疫苗产品[6-8]。另外，贴壁型的传代细胞可用细胞工厂规模化培养，生产中可将细胞生长和病毒繁殖控制在最适条件范围内，提高细胞密度和病毒滴度，实现大批次量、小批间差，产品具有更好的稳定性和安全性，大量节省劳动力、生产场地和能源消耗，降低生产成本，与鸡胚直接增殖病毒的细胞工厂培养细胞增殖病毒的工艺相比具有明显优势[9-11]。血清具有终止胰蛋白酶消化，提供细胞生长所需的贴壁因子、免疫球蛋白、胰岛素等其他营养物质。在动物血清中牛血清又是最常用、最合适、最有效的培养基成分。在培养基中加入适量的牛血清，不仅可以有效促进细胞的生长繁殖，还能够缩短细胞的生长周期，从而加快疫苗的生产，提高疫苗的产量，为疫苗生产企业带来更多的利益[21]。目前市场上血清种类繁多，因此研究不同种类的血清对细胞培养的影响并建立快速有效的血清筛选方法具有十分重要的现实意义[22]。本研究通过国产胎牛血清、进口胎牛血清、国产新生牛血清对MDCK细胞复苏和传代培养的对比试验，在短时间内找到培养MDCK细胞的最佳血清，以期为疫苗研发节约成本、节省时间。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 贴壁培养型MDCK细胞从ATCC引进，引进后由甘肃省动物细胞技术创新中心按《中国药典》2010版的要求建立主细胞库(MDCK-M-60，P60)和工作细胞库(MDCK-W-63，P63)。

1.1.2 培养基 DEME(high-glucous)购自兰州百灵生物技术有限公司。

1.1.3 血清 胎牛血清A(兰州民海，批号20150715)；胎牛血清B(Hyclone，批号SV30087.02-NZJ1221)；新生牛血清C(兰州民海，批号20150901)。使用时按10%(V/V)添加到培养基中。

1.1.4 主要试剂及仪器 0.25%胰蛋白酶(购自兰州百灵生物技术有限公司)；0.2%台盼蓝(Sigma)；结晶紫染液；T75方瓶；6孔细胞培养板；细胞工厂(1层、10层，兰州百灵生物技术有限公司)；生微倒置显微镜(Olympus,CKX-41)；CO2培养箱(ThermoFisher，3111型)；细胞计数仪(美国Countstar，IC1000)；细胞工厂观察装置(北京恒一，XBG-III)等。

1.2 方法

1.2.1 贴壁培养传代稳定性观察

分别用含有10%A、B、C血清的DMEM培养基复苏MDCK工作库细胞，待细胞生长至致密单层时，分别用含有3种类型血清的DMEM培养基培养并连续传代10代，传代时细胞均按照1∶6比例，置于5%CO2、37 ℃培养箱中。每代细胞在24和48 h拍照观察细胞形态、长势及致密程度。

1.2.2 生长曲线及生长动力学分析

取第4代3种类型血清培养生长状态良好且铺满单层的MDCK细胞，分别用0.25%的胰蛋白酶消化，用0.2%台盼蓝染色计数，按有限稀释法将混合均匀的MDCK贴壁细胞悬液稀释至1×104个/mL，接种于24孔细胞培养板，每孔接1 mL细胞悬液。将24孔细胞培养板放置5%CO2、37 ℃培养箱中进行培养，每24 h消化3孔计数，计算平均值。按照此方法，对培养至第6代、第9代的MDCK细胞重复该试验2次，计算3次平均值，绘制细胞生长曲线。并比较3种类型血清培养MDCK细胞的最大増殖密度、倍增时间[12]、比生长速率和平均比生长速率[13]。

倍增时间=T/A，A=log2(Y/X)

X为初始接种细胞数，Y为细胞最大増殖密度前一天的细胞数，T为培养时间。

比生长速率=(lnXn/Xn-1)/(tn-tn-1)

X为活细胞密度，t为培养时间，n和n-1为2个取样计数时间点。

1.2.3 贴壁率分析

贴壁率是指贴壁细胞在低细胞密度下的集落形成，也就是贴壁效率。是判断不同类型血清对细胞增殖能力的重要指标之一。取第4代、第6代和第9代3种类型血清培养生长状态良好且铺满单层的MDCK细胞，按1.2.1所述方法将细胞稀释至1×103个/mL，制成50 cells/4 mL的细胞悬液，在6孔细胞培养板中每孔加入4 mL的细胞悬液，并做平行3孔。将6孔细胞培养板放置5%CO2、37 ℃培养箱中培养8 d，出现集落后，用吸管吸去培养液，用PBS清洗，无水甲醇固定，结晶紫染色。观察并对细胞集落计数，计算平均值。

贴壁率(%)=(所形成集落数/接种细胞数)×100%。

1.2.4 细胞工厂扩大培养验证

取第10代C血清培养生长状态良好且铺满单层的MDCK细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，用0.2%台盼蓝染色计数，扩大培养至1层细胞工厂连续传3代，加150 mL细胞培养液，接种密度为(8～9)×104个/mL，置5%CO2、37 ℃培养箱，用上述方法，接种10层细胞工厂，加1.5 L细胞培养液，接种密度为(8～9)×104个/mL，每12 h用细胞工厂观察台观察，待细胞长成致密单层后，继续传代培养3代，观察细胞生长情况并在长成致密单层时用0.25%的胰蛋白酶消化计数。

1.2.5 数据分析

使用Graphpad prism 8软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 贴壁培养传代稳定性观察

分别用含有A、B、C血清复苏MDCK工作库细胞，连续传代培养10代，3种类型血清均能较好促进细胞的生长增殖，细胞形态呈扁平状，形态较为规则，细胞贴壁后呈三角形及不规则扁平的多角形，中央有扁圆形核，细胞之间相互衔接或呈镶嵌状紧密排列。用A、B血清复苏、培养细胞形态、长势、致密程度无明显差别；C血清复苏、培养MDCK细胞效果较A血清、B血清略欠，但培养细胞生长稳定。3种类型血清分别培养细胞至第4代、第6代和第9代，效果见图1。

2.2 生长曲线及生长动力学分析

3种类型血清培养MDCK细胞生长曲线绘制如图2所示，比生长速率见图3，平均比生长速率见图4，最大增殖密度和倍增时间见表2。细胞生长曲线均呈“S”型；平均比生长速率3种类型血清差异不显著(P>0.05)；最大增殖密度和倍增时间胎牛血清均优于新生牛血清。

图1 3种类型血清分别培养MDCK细胞效果比较(100×)

图2 3种类型血清培养MDCK细胞生长曲线

2.3 贴壁率分析

3种类型血清培养MDCK细胞均形成了有效的集落数，平均集落形成率为(83.84±0.58)%、(85.0±0.87)%、(71.32±0.59)%，进口胎牛血清略高于国产胎牛血清差异显著(P=0.02)、国产新生牛血清低于国产和进口胎牛血清差异极显著(P<0.0001)。集落的形成见图5。贴壁率结果见图6。

图3 3种类型血清培养MDCK细胞比生长速率

* P<0.05

表2 3种类型血清培养MDCK细胞倍增时间和最大增殖密度

2.4 细胞工厂扩大培养验证

C血清在1层和10层细胞工厂中传代培养MDCK细胞，细胞生长良好，排列紧密，不同代次MDCK细胞长成致密单层时细胞形态基本一致，细胞可为六角形或多角形，呈现“铺路石样”，传代过程中细胞生长稳定。在10层细胞工厂中以(8～9)×104个/mL密度接种不同代次MDCK细胞，从细胞传代到长成致密单层所需时间为48～60 h，细胞密度为(40～50)×104个/mL。C血清细胞工厂培养细胞效果见图7。

“*”P<0.05; “****”P<0.0001

24 h48 h1层细胞工厂10层细胞工厂(第2层)10层细胞工厂(第9层)

3 讨论与结论

MDCK细胞目前广泛运用于多种病毒的扩增和纯化，如腺病毒、犬细小病毒、猫粒细胞缺少症病毒、禽流感病毒等[2]。目前国际上已有几家企业批准利用MDCK细胞生产流感疫苗[14]。我国目前还没有自主研发的MDCK细胞生产的流感疫苗上市，但有多家企业正在利用MDCK等细胞进行流感疫苗的研发[15-17]。

在培养贴壁型MDCK细胞时，血清是最常用、最合适、最有效的培养基成分。血清选择不当，不仅会导致细胞生长缓慢、连续传代培养过程中细胞生长不稳定，而且由于血清价格昂贵、大规模生产时成本特别高。血清的选择直接关系到研发进度和疫苗企业生产效益。本试验针对以上问题，分别用贴壁培养、生长曲线和贴壁率试验，评价了国产胎牛血清、进口胎牛血清、国产新生牛血清对MDCK贴壁细胞的促生长效果的影响，并进一步用细胞工厂扩大培养进行验证。结果显示，MDCK细胞在国产新生牛血清中能连续传代和扩大培养，细胞生长动力学较稳定。

本试验通过研究不同类型的牛血清对MDCK细胞培养效果的影响，不仅在短时间内成功筛选出了培养MDCK细胞的最佳血清，而且也为疫苗生产中MDCK细胞扩大培养提供试验依据。这种快速有效的血清筛选方法为疫苗研发、生产大大缩短了时间，节约了疫苗企业生产的成本。

在已发表的文章中，有关在细胞工厂中连续传代和扩大培养验证血清对MDCK贴壁细胞的促生长效果较少，本试验中采用细胞工厂培养细胞，对规模化培养细胞提供参考。连续传代培养试验结果证明，国产新生牛血清可连续传代培养MDCK细胞，细胞生长良好，排列紧密，不同代次MDCK细胞长成致密单层时细胞形态基本一致。相比于国产和进口的胎牛血清，使用国产新生牛血清可大大降低生产企业的成本。

本试验中3种类型血清培养MDCK细胞均形成了有效的集落数，试验结果表明进口胎牛血清略高于国产胎牛血清(P=0.02)，国产新生牛血清低于国产和进口胎牛血清差异极显著(P<0.0001)。这可能与胎牛血清和新生牛血清两者所含的激素及其他活性物质等组份与比例不同有关[18]。如纤维黏连素、胰岛素、α2巨球蛋白、胎球蛋白、转铁蛋白、血小板促生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等在细胞培养中各自发挥的生理功能，还有待进一步研究。另外，胎牛血清的免疫球蛋白含量要远远低于新生牛血清，胎牛的血清相对来说比较纯，所以培养细胞的效果会更佳[19]。除此之外还可能是由于牛血清中存在大量的脂蛋白，贮存不当会造成血清营养，价值的流失，导致给细胞供应营养的能力减弱，造成了细胞的生长缓慢[20-21]。