模拟人胃肠仿生消化对花生肽亚铁抗氧化活性的影响

肖怀秋，李玉珍，赵谋明，林亲录，刘 军，周 全，姜明姣

(1.湖南化工职业技术学院 制药与生物工程学院，湖南 株洲 412000； 2.华南理工大学 食品科学与工程学院，广州 510640； 3.中南林业科技大学 食品科学与工程学院，长沙 410004； 4.湖南中威制药有限公司，湖南 株洲 412000)

1 材料与方法

1.1 试验材料

花生肽亚铁(peanut peptide-ferrous，PPF)，自制，制备方法见参考文献[9]；胃蛋白酶(5 500 U/g)、胰蛋白酶(3 500 U/g)，诺维信(中国)生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。

DK-98-11A型电热恒温水浴箱，天津市泰斯特仪器有限公司；UV-2500紫外可见分光光度计，日本岛津公司；HERMLE Z323K冷冻离心机，德国Hermle公司。

1.2 试验方法

1.2.1 花生肽亚铁的人胃肠仿生消化过程

参考Cruz-Huerta等[10]方法并做修改。准确称取10.0 mg花生肽亚铁于1 000 mL胃仿生消化液中，(37±0.5)℃、100 r/min胃仿生消化2 h，每间隔30 min取样15 mL于8 000 r/min离心20 min，上清液用于抗氧化活性分析，收集的上清液命名为胃仿生消化物(simulated gastro-digesting fractions, SGF)，样品依次命名为SGF1～ SGF4；用0.5 mol/L NaOH调pH至7.6终止胃仿生消化，用十二指肠仿生消化液于(37±0.5)℃、50 r/min仿生消化1 h，每间隔30 min取样15 mL于8 000 r/min离心20 min，取上清液测定抗氧化活性，收集的上清液命名为十二指肠仿生消化物(simulated duodenum-digesting fractions, SDF)，样品依次命名为SDF1～SDF2；调节pH至6.8，继续于(37±0.5)℃、50 r/min小肠仿生消化3 h，每间隔30 min取样15 mL于8 000 r/min离心20 min，取上清液测定抗氧化活性，收集的上清液命名为小肠仿生消化物(simulated intestinal-digesting fractions, SIF)，样品依次命名为SIF1～SIF6。胃肠仿生消化液参考《中国药典》配制[11]。

1.2.2 表面疏水性的测定

准确移取10 mg/L花生肽亚铁或仿生消化物1 mL，加入200 μL 1 mg/mL溴酚蓝，以磷酸盐缓冲溶液为对照，于6 000×g离心15 min，取上清液稀释10倍，在595 nm下测定吸光值(A)。表面疏水性用溴酚蓝结合量表示[12]。

式中：A对为对照的吸光值；A样为样品的吸光值。

1.2.3 DPPH·清除活性测定

取3只试管分别加入下述试剂：①10 mg/L花生肽亚铁或仿生消化物1.5 mL和1.5 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L，溶于95%乙醇)；②10 mg/L花生肽亚铁或仿生消化物1.5 mL和1.5 mL 95%乙醇；③1.5 mL DPPH溶液和1.5 mL蒸馏水。振荡混匀后在室温下避光静置30 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液于517 nm测定吸光值。3个反应液的吸光值分别为A1、A3和A2。按下式计算DPPH·清除率。

DPPH·清除率= [1-(A1-A3)/A2]×100%

式中：S对照为对照组邻苯三酚自氧化速率，ΔA/min；S样品为样品组邻苯三酚自氧化速率，ΔA/min。

1.2.5 ·OH清除活性测定

准确移取0.5 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液于试管中，依次加入1 mL 0.15 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)和0.5 mL去离子水，充分混匀后，加入0.5 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液，混匀后，加入0.5 mL 0.01%双氧水作为损伤管，于37℃水浴60 min后于536 nm测定吸光值(A损)；未损伤管以0.5 mL蒸馏水代替损伤管中0.5 mL双氧水，于536 nm测定吸光值(A未)；样品管以0.5 mL样品代替损伤管中0.5 mL蒸馏水，于536 nm测定吸光值(A样)[13]。按下式计算·OH清除率。

·OH清除率=(A样-A损)/(A未-A损)×100%

1.2.6 亚油酸氧化抑制活性测定

准确移取10 mg/L花生肽亚铁或仿生消化物3.0 mL，加入2.0 mL 0.05 mol/L亚油酸-乙醇溶液，充分混匀，用硅胶塞密封并于60℃保温，每12 h取反应液0.1 mL，加入4.7 mL 75%乙醇、0.1 mL 30%硫氰酸铵和0.1 mL 0.02 mol/L FeSO4(3.5%HCl溶液)，混合均匀，5 min后于500 nm测定吸光值(A500)[13]。

1.2.7 脂质过氧化抑制活性测定

构建以卵黄脂蛋白为底物的脂质过氧化模型进行脂质过氧化抑制活性评价。样品管包括1∶25稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积pH 7.45、0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶物(PBS)配制，4℃保存，用前摇匀)0.2 mL花生肽亚铁或仿生消化物1.0 mL，用PBS补足至2.0 mL；对照管提前加入0.5 mL 20%三氯乙酸(TCA)溶液，并加入除样液外其他试剂。将上述两管同时于(37±0.5)℃保温60 min，取出后，样品管加入0.5 mL 20% TCA溶液，静置15 min后，与对照管一并于3 500 r/min离心10 min。分别取上清液2.0 mL，加入0.8%硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0 mL，加塞于100℃水浴20 min，取出冷却至室温；以空白管调零(空白管以2.0 mL PBS代替)，于532 nm测定吸光值[14]。按下式计算脂质过氧化(LPO)抑制率。

LPO抑制率=(A对-A样)/A对×100%

式中：A对为对照管的吸光值；A样为样品管的吸光值。

1.2.8 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 胃肠仿生消化对花生肽亚铁表面疏水性的影响(见表1)

表1 胃肠仿生消化对花生肽亚铁表面疏水性的影响

注：相同字母表示差异不显著(p>0.05)，不同字母表示差异显著(p<0.05)。下同。

由表1可以看出：当胃仿生消化30 min时，花生肽亚铁胃仿生消化物的表面疏水性与未仿生消化的花生肽亚铁表面疏水性差异不显著，胃仿生消化120 min时表面疏水性显著增加至(11.46±0.41)μg；十二指肠仿生消化阶段表面疏水性增幅不显著；仿生消化270 min时，表面疏水性达到最大((15.84±0.33)μg)，继续进行小肠仿生消化，表面疏水性变化不显著，说明仿生消化270 min时疏水性基团已充分暴露。研究表明，多肽疏水基团暴露有利于发挥其抗氧化活性[15-16]。

2.2 胃肠仿生消化对花生肽亚铁DPPH·清除活性的影响(见表2)

表2 胃肠仿生消化对花生肽亚铁DPPH·清除活性的影响

由表2可以看出：VC质量浓度为0.4 mg/mL时DPPH·清除率为(73.50±0.29)%，VC质量浓度继续增加，DPPH·清除率增加不显著；花生肽亚铁及其仿生消化物具有较好的DPPH·清除活性，未仿生消化的花生肽亚铁DPPH·清除率为(78.73±0.94)%，胃仿生消化120 min时，DPPH·清除率显著增加到(82.53±1.18)%，十二指肠仿生消化DPPH·清除率变化不显著，小肠仿生消化240 min时，DPPH·清除率显著增加到(87.97±0.81)%，进一步延长小肠仿生消化时间，DPPH·清除率不再显著性增加，其可能原因是DPPH·是脂溶性自由基，疏水性较强的多肽常具有较高DPPH·清除活性[15]。

2.3 胃肠仿生消化对花生肽亚铁清除活性的影响(见表3)

表3 胃肠仿生消化对花生肽亚铁清除活性的影响

2.4 胃肠仿生消化对花生肽亚铁·OH清除活性的影响(见表4)

由表4可以看出：VC质量浓度为0.6 mg/mL时，·OH清除率达到(98.84±0.41)%；未仿生消化的花生肽亚铁·OH清除率为(65.94± 0.45)%，胃仿生消化120 min，·OH清除率显著上升至(72.36±0.66)%，十二脂肠仿生消化完成后，·OH 清除率提升到(78.64±0.52)%，随后的小肠仿生消化进一步提升了消化物的·OH清除率，仿生消化300 min时·OH清除率显著增加到(83.13±0.52)%，继续进行小肠仿生消化，·OH清除率增幅不显著，相比VC(0.6～1.0 mg/mL)对·OH的清除效果，花生肽亚铁及其仿生消化物的·OH清除能力较弱。

表4 胃肠仿生消化对花生肽亚铁·OH清除活性的影响

2.5 胃肠仿生消化对花生肽亚铁亚油酸氧化抑制活性的影响(见表5)

表5 胃肠仿生消化对花生肽亚铁亚油酸氧化抑制活性的影响

注：CK为亚油酸；不同小写字母表示同列间比较具有显著差异(p<0.05)，相同小写字母表示同列间比较不具有显著差异(p>0.05)，下同。

2.6 胃肠仿生消化对花生肽亚铁脂质过氧化抑制活性的影响(见表6)

表6 胃肠仿生消化对花生肽亚铁脂质过氧化抑制活性的影响

3 结 论