马蔺籽油的索氏提取工艺、成分分析及抗氧化活性研究

栾真杰，李佩佩，李 朵，皮 立，孟晓萍，孙 菁

(1.中国科学院西北高原生物研究所 青海省青藏高原特色生物资源研究重点实验室，西宁810008； 2.中国科学院大学，北京100049)

马蔺(IrislacteaPall. var.chinensis(Fisch.) Koidz.)又名马莲、马兰花，为鸢尾科鸢尾属植物，常作为观赏植物用于城市绿化[1]。马蔺籽，又名蠡实，收录于《本草纲目》草部，主治寒疝诸疾、喉痹等症。蒙藏医理论认为，马蔺籽主治胃痉挛、烫伤、内外虫疾、阑尾炎、身目发黄等症[2-3]。自马蔺籽种皮中提取的马蔺子素及其相关制剂马蔺子素胶囊已收载于我国新药转正标准，而对马蔺籽种仁部分的研究则相对较少。

通过对马蔺籽的显微特征研究发现，马蔺籽种仁部分含有大量油细胞[4]，其含油量在3%～12%。药理实验证明马蔺籽油对小鼠无毒，主要含有亚油酸及油酸[5-6]，这些脂肪酸具有抗菌，降低血清胆固醇，预防和治疗高血压及动脉粥样硬化症、冠心病等作用[7-9]。但是关于马蔺籽油的提取方法、化学成分组成及生物活性方面的研究较少。因此，本研究以石油醚为提取溶剂，在单因素实验的基础上采用响应面法优化马蔺籽油索氏法提取工艺，用GC-MS分析马蔺籽油的脂肪酸组成及不皂化物组成，并测定其体外抗氧化活性，以期为马蔺籽资源的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

马蔺籽，购自药材市场，经中国科学院西北高原研究所卢学峰研究员鉴定为鸢尾科鸢尾属植物马蔺(IrislacteaPall. var.chinensis(Fisch.) Koidz.)的干燥成熟果实，所购种子颗粒饱满、无霉变，存放于中国科学院西北高原生物研究所。石油醚(沸程60～90℃)、氢氧化钾、甲醇、正己烷、三氟化硼等均为分析纯；标准品菜油甾醇(纯度>98%)、β-谷甾醇(纯度>98%)、豆甾醇(纯度>95%)，北京世纪奥科生物技术有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，纯度>98%)，APExBIO公司；总抗氧化能力(T-AOC)测试盒(A015-3 FRAP法 100T)，南京建成生物工程研究所；抗坏血酸，成都普菲德生物技术有限公司。

1.1.2 仪器与设备

Thermo 1300/8000Evo气相色谱-质谱联用仪，Epoch2微孔板分光光度计(美国伯腾仪器有限公司)，HH-6型数显恒温水浴锅，YB-700多功能粉碎机，ZFJ-200中草药粉碎机，N-1100旋转蒸发仪，电热鼓风干燥箱，SHB-III循环水真空泵。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理

筛除马蔺籽中的碎壳、残叶等杂质，然后将马蔺籽置于50℃烘箱中烘干至恒重。用多功能粉碎机碎皮后过20目筛，除去马蔺籽种皮，得到马蔺籽种仁。将种仁用粉碎机粉碎后过40目筛，装于自封袋中4℃冷藏备用。

1.2.2 马蔺籽油的提取

精密称取10.00 g马蔺籽种仁粉，以石油醚为溶剂，用索氏提取器提取一定时间，得到石油醚提取液，40℃旋蒸除尽溶剂，置于烘箱中干燥至恒重，得马蔺籽油。按下式计算马蔺籽油得率[10]。

马蔺籽油得率=马蔺籽油质量/原料质量×100%

1.2.3 马蔺籽油理化性质分析

分别参照GB/T 22500—2008、GB/T 5532—2008、GB/T 5530—2005、GB/T 5534—2008、GB/T 5538—2005、GB/T 5535.2—2008测定紫外吸光度、碘值、酸价、皂化值、过氧化值和不皂化物含量。

1.2.4 马蔺籽油脂肪酸组成分析

1.2.4.1 马蔺籽油的甲酯化

参照GB 5009.168—2016的方法，称取马蔺籽油0.1 g于100 mL平底烧瓶中，加入8 mL 2%氢氧化钾-甲醇溶液，在80℃水浴上回流直至油滴消失，从回流冷凝器上端加入7 mL 15%三氟化硼-甲醇溶液，继续回流2 min，冷却至室温，准确加入10 mL正庚烷振摇2 min，再加入饱和氯化钠溶液振摇静置分层，吸取上层正庚烷提取液5 mL于试管中，加入3～5 g无水硫酸钠，振摇1 min，静置5 min，吸取上层溶液到进样瓶中待GC-MS分析。

1.2.4.2 GC-MS分析

用GC-MS对马蔺籽油脂肪酸组成进行分析，通过检索NIST14标准谱库和人工解谱的方法，分析图谱中的主要成分，并采用面积归一化法定量。

GC-MS分析条件：安捷伦DB-FFPA毛细管色谱柱(100 m×0.25 mm，0.25 μm)；进样口温度280℃；载气为氦气；进样量1 μL；分流比20∶1；程序升温为50℃保持1 min，以25℃/min升温至175℃，再以4℃/min升温至230℃，保持5 min；电离方式为电子轰击离子源(EI)；柱头压力230 kPa；传输线温度280℃。

1.2.5 马蔺籽油不皂化物的组成分析

分别称取7.70 mg菜油甾醇、11.12 mg 豆甾醇和10.28 mgβ-谷甾醇于3个10 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容，配成甾醇标准溶液。从上述3种标准溶液中分别准确移取0.4 mL于2 mL离心管中，混匀，获得3种甾醇混标溶液进行GC-MS分析。以甾醇质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到菜油甾醇标准曲线回归方程y1=1.914 42E7x+8.495 44E7(r=0.999 18)，豆甾醇标准曲线回归方程y2=2.506 25E7x-1.454 65E7(r=0.999 78)，β-谷甾醇标准曲线回归方程y3=1.474 98E7x+4.055 37E7(r=0.994 11)。

将按照GB/T 5535.2—2008制得的马蔺籽油不皂化物溶于5 mL正己烷中进行GC-MS分析，各色谱峰相应的质谱图采用NIST14标准谱库进行检索，并逐个解析各峰相应的质谱图，确定化合物，采用面积归一化法计算各化合物的相对含量。根据3种甾醇标准品的回归方程计算马蔺籽油中菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇的含量。

GC-MS分析条件：J&W DB-5MS UI毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)；进样口温度275℃；进样量 1.0 μL；分流比10∶1；载气为高纯氦气，流速1.0 mL/min；程序升温为初始温度180℃，以15℃/min的升温速率升至280℃，保持25 min；EI离子源，电子能量70 ev；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；传输线温度280℃；质量范围35～650，全扫描方式；溶剂延迟时间2 min。

1.2.6 马蔺籽油抗氧化能力测定

1.2.6.1 DPPH自由基清除率的测定

参考Ardestani等[11]的方法，分别取不同质量浓度(0.875、1.750、3.500、7.000、14.000、28.000、56.000 mg/mL)的马蔺籽油溶液2 mL，各加入0.2 mmol/mL的DPPH-乙醇溶液2 mL，混合均匀，于常温下避光反应30 min，517 nm波长处测吸光度(As)，以无水乙醇为空白对照(Ab)，以VC为阳性对照，按下式计算DPPH自由基清除率。

1.2.6.2 总抗氧化能力的测定

采用FRAP法[12]测定马蔺籽油的总抗氧化能力。按照总抗氧化能力测试盒说明制备工作液，37℃水浴30 min，依次加入空白对照(水)和不同质量浓度(7、14、28、56、112、168、224、280 mg/mL)的马蔺籽油溶液，室温反应6 min，测定反应液在593 nm处的吸光度，每个样品重复3次。以FeSO4·7H2O 为标准物质，分别配制浓度为0.15、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50 mmol/L的FeSO4溶液，按照上述方法反应后，测定在593 nm处的吸光度，以吸光度为横坐标，对应的标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线(回归方程为y=3.162 2x-0.365 5，r=0.997 0)。将样品的吸光度代入标准曲线回归方程，计算得到FeSO4的浓度表示样品的总抗氧化能力。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 提取时间对马蔺籽油得率的影响

在料液比1∶15、提取温度80℃的条件下，考察提取时间对马蔺籽油得率的影响，结果如图1所示。

图1 提取时间对马蔺籽油得率的影响

由图1可以看出，在1～4 h时，马蔺籽油得率随提取时间的延长不断提高，且增长速度很快，而在4～6 h时，马蔺籽油得率增长缓慢。可能在4 h时马蔺籽油提取已经基本完全，继续延长提取时间马蔺籽油得率趋于稳定。因此，选择提取时间2～6 h进行响应面实验。

2.1.2 提取温度对马蔺籽油得率的影响

在料液比1∶15、提取时间4 h的条件下，考察提取温度对马蔺籽油得率的影响，结果如图2所示。

图2 提取温度对马蔺籽油得率的影响

由图2可以看出，当提取温度在65～80℃时，马蔺籽油得率随着提取温度的升高迅速增大，可能是温度的升高增加了溶剂分子和油脂分子的动能而有利于油脂分子的扩散。当提取温度在80～90℃时，马蔺籽油得率有所下降，可能是因为当温度接近石油醚沸程顶端时，石油醚回流速度过快，其在提取管中时间过短，难以充分提取马蔺籽油，导致得率下降。因此，选择70～90℃进行响应面实验。

2.1.3 料液比对马蔺籽油得率的影响

在提取温度80℃、提取时间4 h的条件下，考察料液比对马蔺籽油得率的影响，结果如图3所示。

图3 料液比对马蔺籽油得率的影响

由图3可以看出，在料液比为1∶(9～21)时，马蔺籽油得率随料液比增加而逐渐增大，当料液比超过1∶21时，马蔺籽油得率反而有所下降。其可能原因是当溶剂量已经满足虹吸并且能充分完成提取马蔺籽油的条件时，溶剂用量过多会造成整体溶剂中低沸点的溶剂含量较高，回流速度过快，得率略有下降。综合考虑，选择料液比1∶(15～27)进行响应面实验。

2.2 响应面优化实验

在单因素实验的基础上，选择提取时间、提取温度和料液比3个影响因素，以马蔺籽油得率(Y)为响应值，采用Box-Behnken实验原理对马蔺籽油提取工艺进行优化。响应面实验因素水平见表1，响应面实验设计及结果见表2，回归模型方差分析见表3。

表1 响应面实验因素水平

表2 响应面实验设计及结果

表3 回归模型方差分析

经响应面回归分析得到马蔺籽油最佳提取工艺条件为提取时间5.917 h、提取温度70.066℃、料液比1∶26.213，在此条件下马蔺籽油得率的理论值达到11.23%。考虑到实际操作，将最佳工艺条件修正为提取时间6 h、提取温度70℃、料液比1∶26。在最佳工艺条件下进行5次验证实验，马蔺籽油得率平均值为11.20%，与预测值相对误差为0.27%，说明响应面法得到的提取条件是可行的。

2.3 马蔺籽油的理化性质

用紫外全波长扫描的方法确定马蔺籽油的最大吸收波长为265 nm，在此波长下配制质量浓度为0.124 1 g/100 mL的马蔺籽油溶液，测得紫外吸光度为4.667。马蔺籽油呈黄色透明状。经测定，马蔺籽油不皂化物含量1.37%，皂化值(KOH)185.2 mg/g，酸价(KOH)0.038 mg/g，碘值(I)113.7 g/100 g，过氧化值5.159 mmol/kg。油脂的碘值较高，表明其不饱和程度较高，容易氧化。

2.4 马蔺籽油的脂肪酸组成

马蔺籽油主要脂肪酸组成及相对含量见表4。由表4可知，马蔺籽油主要含有19种脂肪酸，其中饱和脂肪酸主要为棕榈酸(6.88%)及硬脂酸(2.38%)，不饱和脂肪酸主要为亚油酸(45.32%)和油酸(38.42%)，不饱和脂肪酸含量为84.71%。亚油酸是功能性多不饱和脂肪酸中被最早认识的一种，是必需脂肪酸，具有降低血清胆固醇水平作用，我国2015版药典将亚油酸乙酯丸剂、滴剂作为预防和治疗高血压及动脉粥样硬化症、冠心病的药物[8]。此外，亚油酸还是ω-6长链多不饱和脂肪酸，尤其是γ-亚麻酸和花生四烯酸的前体[9]。

表4 马蔺籽油主要脂肪酸组成及相对含量 %

2.5 马蔺籽油不皂化物的组成

马蔺籽油不皂化物的组成及相对含量见表5。

由表5可见，对马蔺籽油不皂化物共鉴定出36种成分，其中甾醇类化合物9种，分别为β-谷甾醇(19.51%)、豆甾醇(11.80%)、豆甾-5，24(28)-二烯-3β-醇(11.64%)、菜油甾醇(9.04%)、α1-谷甾醇(4.98%)、9,19-环羊毛甾-24-烯-3β-醇(3.71%)、24-亚甲基-9,19-环羊毛甾烯-3β-醇(3.02%)、蒲公英甾醇(1.90%)、γ-扶桑甾醇氧化物(0.59%)，总含量高达66.19%。含量在5%以上的甾醇有β-谷甾醇、豆甾醇、豆甾-5，24(28)-二烯-3β-醇和菜油甾醇。β-谷甾醇具有包括抗炎、抗癌和免疫调节特性在内的多种药理活性[13]，豆甾醇及菜油甾醇与低胆固醇油联用可以预防高脂饮食诱导的增重、肝损伤和高脂血症[14]。为此，采用标准品对马蔺籽油中这3种甾醇含量进行了测定，结果表明β-谷甾醇含量为725.87 mg/kg，豆甾醇含量为1 231.55 mg/kg，菜油甾醇含量为410.50 mg/kg。其中豆甾醇含量比其他13种常见的植物油(米糠油1 060.44 mg/kg，大豆油248.42 mg/kg、玉米油238.71 mg/kg、芝麻油226.40 mg/kg、花生油181.58 mg/kg、棕榈仁油134.46 mg/kg、葵花籽油114.93 mg/kg、茶籽油78.70 mg/kg、椰子油78.37 mg/kg、小麦胚芽油75.62 mg/kg、棕榈油55.23 mg/kg、菜籽油30.21 mg/kg、橄榄油11.66 mg/kg)[15]含量高。马蔺籽油不皂化物中的豆甾-5，24(28)-二烯-3β-醇，因其侧链中亚乙基基团的结构，在煎炸油中起着抗氧化剂和抗聚合剂的作用，在煎炸过程中对其他抗氧化剂也具有协同作用。高含量的豆甾-5，24(28)-二烯-3β-醇可以保证食品加工过程中更高的热稳定性[16]。

表5 马蔺籽油不皂化物的组成及相对含量 %

2.6 马蔺籽油的抗氧化能力

2.6.1 马蔺籽油DPPH自由基清除能力(见图4)

图4 马蔺籽油对DPPH自由基的清除能力

由图4可知，阳性对照VC的DPPH自由基清除率最高可达84.94%，说明该方法可行有效。马蔺籽油的DPPH自由基清除率随其质量浓度的增加而增大，在一定质量浓度范围内呈现较好的量效关系。在马蔺籽油质量浓度为28.000 mg/mL时，DPPH自由基清除率达61.15%。经计算，马蔺籽油DPPH自由基清除率的IC50(DPPH自由基清除率达50%时马蔺籽油的质量浓度)为19.860 mg/mL。

2.6.2 马蔺籽油的总抗氧化能力(见图5)

FRAP法反映了被测物对Fe3+的还原能力[12]。由图5可知，不同质量浓度的马蔺籽油对Fe3+均具有一定的还原能力，且随着质量浓度的升高，还原能力呈现上升趋势。当马蔺籽油质量浓度为280 mg/mL 时，总抗氧化能力达0.202 4 mmol/L。

图5 不同质量浓度马蔺籽油的总抗氧化能力

3 结 论

以石油醚为提取溶剂，通过单因素实验和响应面实验优化马蔺籽油的提取工艺条件，得到最佳工艺条件为提取时间6 h、提取温度70℃、料液比1∶26，在此条件下马蔺籽油得率为11.20%。马蔺籽油在265 nm处的吸光度为4.667，呈现黄色透明状，皂化值(KOH)185.2 mg/g，酸价(KOH)0.038 mg/g，碘值(I)113.7 g/100 g，过氧化值5.159 mmol/kg。马蔺籽油不饱和脂肪酸含量为84.71%，主要为亚油酸(45.32%)及油酸(38.42%)；不皂化物中甾醇类化合物总含量高达66.19%，主要为β-谷甾醇(19.51%)、豆甾醇(11.80%)、豆甾-5，24(28)-二烯-3β-醇(11.64%)和菜油甾醇(9.04%)。马蔺籽油DPPH自由基清除率的IC50值为19.860 mg/mL，FRAP法测定其在质量浓度280 mg/mL时总抗氧化能力为0.202 4 mmol/L。