加热联合酶解大豆7S蛋白的分子结构及抗原性研究

朱 丽，孔祥珍，华欲飞

(江南大学 食品学院，江苏 无锡214122)

大豆是一种营养价值较高的家庭用或工业加工用食品材料，应用性极广[1]。但大豆作为八大食物致敏原之一，轻者可出现过敏性皮炎、腹痛腹泻、恶心呕吐等过敏反应，严重者会休克甚至死亡[2-3]。大豆中的过敏成分主要来源于大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白，β-伴大豆球蛋白是伴大豆球蛋白(7S)的主要存在形式，且后者比前者更易引起过敏反应[4]，研究发现组成β-伴大豆球蛋白的3种亚基——α′、α及β亚基都具有致敏性[5]。

热处理是食品加工中最常用的工序之一。加热处理能够引起蛋白质的变性，由于分子相互作用发生聚集和/或二硫键重排等导致蛋白质构象表位的破坏，在某些情况下大豆致敏性可因此被降低[6]，但之后的研究发现新暴露出的IgE的结合位点会导致大豆致敏性增加[7]。所以，加热处理对于大豆致敏性的降低并不是很理想。蛋白酶酶解常用于降低抗原蛋白的致敏性，其通过使肽段断裂，从而最大程度地破坏蛋白的线性表位及构象表位。Keum等[8]研究发现，大豆7S蛋白经过胃蛋白酶酶解，其抗原性降低了50%以上。黄婷等[9]用碱性蛋白酶处理β-伴大豆球蛋白40 min，β-伴大豆球蛋白抗原抑制率为33.48%。Wang等[10]用胰蛋白酶酶解豆粕12 min，β-伴大豆球蛋白抗原性残留率约为30%，但碱性蛋白酶酶解10 min，抗原性残留率仅为4%。目前关于大豆蛋白经加热预处理后，再进行蛋白酶酶解对其分子结构及抗原性的影响方面报道较少。

本研究采用不同的加热条件联合不同的酶解方式考察大豆7S蛋白分子结构及抗原性的变化。采用SDS-PAGE考察酶解后大豆7S蛋白的降解情况，采用间接竞争ELISA法考察酶解物的抗原性，并通过质谱鉴定抗消化肽段的蛋白来源，旨在为脱敏食品的加工处理提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

低温脱脂豆粕，山东禹王生态食业有限公司；胃蛋白酶(≥1 200 U/g)、胰蛋白酶(1∶250)、氢氧化钠、浓盐酸、浓硫酸、亚硫酸氢钠、氯化钠、氯化钾、五水硫酸铜、过硫酸铵、甘氨酸、乙酸、甲醇、十二烷基磺酸钠(SDS)、2,4-二硫苏糖醇(DTT)、考马斯亮蓝R-250、三氯乙酸(TCA)，国药集团化学试剂有限公司；丙烯酰胺(Acr)，北京百灵威科技有限公司；β-伴大豆球蛋白定量检测试剂盒，上海酶联生物技术公司。

Himac CR21 GII 冷冻离心机，日本日立公司；K9840半自动凯氏定氮仪；酶标仪，Thermo Scientific公司；SC-15 智能节能恒温槽；pH计，梅特勒-托利多公司；垂直电泳仪、凝胶成像仪，伯乐生命医学产品有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大豆7S蛋白的提取

参照Nagano等[11]的方法并做适当修改。将低温脱脂豆粕与10倍体积去离子水室温低速搅拌混合1 h，两层纱布过滤去除残渣，上清液在4℃下15 800g离心30 min，加入亚硫酸氢钠溶液使其质量浓度为0.98 g/L，然后调节pH至6.4，静置过夜， 4℃下12 000g离心20 min，收集上清液。在上清液中加入氯化钠使其浓度为0.25 mol/L,调节pH至5.0，4℃下15 800g离心30 min，再次收集上清液，加入等体积4℃预冷去离子水，调pH至4.8，4℃下12 000g离心20 min，收集沉淀，调pH至7.0，浓缩干燥，得大豆7S蛋白，4℃储藏备用。

1.2.2 蛋白质含量的测定

按照GB 5009.5—2016中凯氏定氮法进行蛋白质含量测定。

1.2.3 加热处理

配制3%的大豆7S蛋白溶液，于70、80、90℃恒温水浴中分别加热10、20 min，加热完毕后置于冰水浴中迅速冷却，4℃保存待用。

1.2.4 蛋白酶酶解

配制大豆7S蛋白溶液，调节各蛋白酶酶解最适温度和最适pH，按照酶底比1∶50加入蛋白酶，酶解过程中保持pH稳定。反应10～120 min分别取样，调pH至7.0，95℃水浴10 min灭酶，冰水冷却，待用。

1.2.5 热处理联合胰蛋白酶酶解

将1.2.3中加热后的大豆7S蛋白溶液调节pH至7.5，温度37℃，按照酶底比1∶50加入胰蛋白酶，酶解过程中保持pH稳定。分别在反应10、20、30、60、120 min时取样，调节pH至7.0，95℃水浴10 min灭酶，冰水冷却，待用。

1.2.6 热处理联合胃蛋白酶酶解

将1.2.3中加热后的大豆7S蛋白溶液调节pH至1.5，温度37℃，按照酶底比1∶50加入胃蛋白酶，酶解过程中保持pH稳定[12]。分别在反应30、60、120 min时取样，调节pH至7.0，95℃水浴10 min灭酶，冰水冷却，待用。

1.2.7 SDS-PAGE

将大豆7S蛋白和酶解后的大豆7S蛋白酶解液分别用纯水稀释至蛋白质含量0.4%，与等量的蛋白质溶解液、0.1%溴酚蓝、0.3%DTT混合，于100℃加热10 min。凝胶电泳以电压260 V、电流13 mA运行2 h，取出胶条，浸泡于固定液(7%乙酸，40%甲醇)中1 h，用考马斯亮蓝R-250染色至少2 h，然后于去离子水中脱色至背景清晰[13-14]。

1.2.8 质谱鉴定抗消化肽段

采用MALDI-TOF/TOF质谱联用技术对大豆7S蛋白酶解物中的抗消化肽段进行鉴定。用串联飞行时间质谱仪(AB SCIEX 5800 MALDI-TOF/TOF)进行测试，Flex Analysis和Bio tools软件进行分析。肽段由NCBI数据库匹配[15]。

1.2.9 ELISA法分析抗原性

按照β-伴大豆球蛋白定量检测试剂盒的使用说明书进行实验。根据试剂盒提供的线性范围，将处理好的样品用样品稀释液稀释一定的倍数，96孔酶标板加入50 μL/孔稀释样，再加入50 μL/孔的抗体工作液，轻轻晃匀，37℃温育30 min；弃液，加洗涤液300 μL/孔，保持10 s，洗涤4次，用吸水纸拍干；加入HPR标记二抗100 μL/孔，37℃温育30 min；同上洗涤、拍干后，加入混好的显色液100 μL/孔，37℃温育15 min，最后加入终止液50 μL/孔，轻晃混匀后，立即于酶标仪450/630 nm读取OD值，根据标准曲线计算过敏原含量。以抗原性降低率表示各处理方法降低抗原的效果，按下式计算。

抗原性降低率=(对照组的过敏原含量-酶解物中的过敏原含量)/对照组中的过敏原含量×100%

1.2.10 数据处理

采用Image Lab软件分析SDS-PAGE图谱；实验数据均取3次测得的平均值，采用SPSS软件分析其差异性，P< 0.05表示差异显著；采用Excel、Origin8.5软件作图。

2 结果与讨论

2.1 胰蛋白酶酶解大豆7S蛋白的相对分子质量分布及抗原性变化

2.1.1 胰蛋白酶酶解大豆7S蛋白的SDS-PAGE分析(见图1)

注：M为Marker；0为未经任何处理的大豆7S蛋白；图(a)的1～5为未经加热预处理的大豆7S蛋白分别酶解10、20、30、60、120 min；图(b)、(c)、(d)中1～5为加热预处理10 min后再分别酶解10、20、30、60、120 min；1′～5′为加热预处理20 min后再分别酶解10、20、30、60、120 min。图1 不同酶解条件下制备的大豆7S蛋白胰蛋白酶酶解物的SDS-PAGE谱图

实验室制备的大豆7S蛋白的蛋白质含量为91.18%。由图1(a)可知，条带0经Image Lab分析可得大豆7S/11S蛋白的比值为2.97，与吴超[16]的结果一致。胰蛋白酶能专一性地酶解由精氨酸、赖氨酸的羧基端形成的肽键。随着胰蛋白酶酶解，未经加热预处理的大豆7S蛋白的α′亚基快速降解，α亚基呈规律性地被降解，直至120 min时完全消失，而β亚基则表现出较高的消化稳定性，这与王锦欣等[17]的结论基本一致。此时产生的新条带质谱鉴定结果如表1所示。由表1可知，在50～75 kDa之间产生的一些新条带主要来自α′亚基和α亚基，在20～25 kDa之间产生的一些新的条带主要为sucrose-binding protein-like(d)、α′亚基(e)及β亚基(f)，且在β亚基位置出现降解的α亚基(c)。

表1 胰蛋白酶酶解物的质谱鉴定结果

从图1(b)可知，与图1(a)相比，α′亚基依然很快被降解至消失，而α、β亚基的降解程度均加大，且主要产生20～25 kDa间的条带，以及15 kDa下的小分子肽段。70℃加热预处理10 min和20 min再酶解的电泳图谱差异不大，说明两种预处理方式导致的蛋白结构展开程度相近。由图1(c)可知，由于大豆7S蛋白变性温度接近80℃[18]，当酶解10 min时，α′、α及β亚基基本都被降解, 只产生约25 kDa的新条带。由图1(d)可知，蛋白降解情况与图1(c)基本一致，且在酶解60、120 min时，靠近25 kDa的新条带灰度有所减弱，逐渐出现相对分子质量约20 kDa的新条带，大量酶解小肽都集中在15 kDa以下。

2.1.2 胰蛋白酶酶解大豆7S蛋白的抗原性变化(见图2)

由图2(a)可知，随着酶解时间的延长，β-伴大豆球蛋白的抗原性显著降低(P<0.05)，在酶解120 min后，抗原性降低率约为40%。从电泳图上看，可能与残留的β亚基以及产生的来源于α′、α亚基的酶解肽链有关。

与未经加热预处理的样品相比，70℃加热预处理后，随着胰蛋白酶酶解时间的延长，尽管电泳谱图中图1(a)和图1(b)相差较大，但对于抗原性的影响趋势及降低率相似。由图2(b)可知，样品经过80℃或90℃加热预处理后，再进行胰蛋白酶酶解，其抗原性降低程度显著增大(P<0.05)，最高可达79.99%。推测可能是加热导致蛋白结构展开，暴露更多内部的酶催化位点，故酶解效果较好，同时导致部分暴露的抗原表位被破坏。

注：图(b)中1～5为70℃加热预处理后，分别酶解10、20、30、60、120 min；6～10为80℃加热预处理后，分别酶解10、20、30、60、120 min；11～15为90℃加热预处理后，分别酶解10、20、30、60、120 min。图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图2 不同酶解条件下制备的大豆7S蛋白胰蛋白酶酶解物的抗原性降低率

2.2 胃蛋白酶酶解大豆7S蛋白的相对分子质量分布及抗原性变化

2.2.1 胃蛋白酶酶解大豆7S蛋白的SDS-PAGE分析(见图3)

与胰蛋白酶的酶解位点不同，胃蛋白酶主要酶解由芳香族氨基酸及其他疏水性氨基酸形成的肽键。通过预实验，确定胃蛋白酶酶解大豆7S蛋白的酶解时间分别选取30、60 min和120 min进行考察。由图3(a)可知，未经加热预处理大豆7S蛋白经胃蛋白酶酶解30～120 min后，α′、α亚基略微被降解，而β亚基的灰度逐渐增加，且50～75 kDa之间也产生一条逐渐加深的新条带，同时大豆7S蛋白中含有的11S的A、B肽链优先被酶解，这与赵谋明[12]、刘晓毅[19]等的研究结果一致。由图3(b)可知，在70℃下加热10 min及20 min后再酶解，α′、α及β亚基均大幅度降低，且与胰蛋白酶酶解情况相同的是均产生25 kDa附近的新条带；同样，由图3(c)、(d)可知，在80、90℃下酶解60 min后，α′、α及β亚基基本消失，且均产生位置集中在20 kDa以下的小分子肽段。综上所述，经过加热预处理后，采用胃蛋白酶酶解，大豆7S蛋白的3种亚基在电泳谱图中的条带很快消失，同时在37 kDa以下出现大量不同相对分子质量的肽链，这些肽链主要为致敏条带α′、α及β亚基的酶解产物。

注：M为Marker；0为未经任何处理的大豆7S蛋白；图(a)的1～3为未经加热预处理的大豆7S蛋白分别酶解30、60、120 min；图(b)、(c)、(d)1～3为加热预处理10 min后再分别酶解30、60、120 min；1′～3′为加热预处理20 min后再分别酶解30、60、120 min。图3 不同酶解条件下制备的大豆7S蛋白胃蛋白酶酶解物的SDS-PAGE谱图

2.2.2 胃蛋白酶酶解大豆7S蛋白的抗原性变化(见图4)

由图4(a)可知，胃蛋白酶酶解物的抗原性降低率随着酶解时间的延长而增加，抗原性降低率为3.8%～4.5%。因为其主要致敏蛋白α′、α及β亚基降解程度不大，导致还存在大量的抗原表位。

由图4(b)可知，在相同酶解条件下，不同的加热预处理时间(10、20 min)对酶解物的抗原性的影响较小；同时，结合图3发现酶解物中肽链组成基本一致。在相同的加热预处理时间下，随着加热预处理温度升高，酶解物的抗原性降低率总体呈现先增大后降低的趋势。70℃加热预处理10 min后，随着酶解时间的延长，其抗原性降低率从10%逐渐增大到37%左右，结合相应电泳谱图，推测可能是α′、α及β亚基大幅度降解导致的。80℃加热预处理条件下， 抗原性降低率从20%显著增加到约50%(P< 0.05)，此时α′、α亚基基本消失，导致内部部分抗原表位暴露，从而被破坏，进而抗原性大大降低。90℃加热预处理条件下，条带的变化情况与80℃类似，但是ELISA的结果显示，酶解30 min后抗原性降低率约为20%，而酶解120 min后抗原性降低率约为10%。推测这可能与产生的新肽段的聚集有关，即虽然线性表位被破坏，但却出现新的构象表位，从而导致抗原性增加。

综上，加热预处理可以促进蛋白酶对大豆7S蛋白的酶解，且更大程度地降低抗原性；经过80℃或90℃加热预处理后，再进行胰蛋白酶酶解，其抗原性降低程度明显增大，最高可达79.99%；加热预处理后再经胃蛋白酶酶解，其抗原性降低率最大可达50.4%。

注：图(b)中1～3为70℃加热预处理后，分别酶解30、60、120 min；4～6为80℃加热预处理后，分别酶解30、60、120 min；7～9 为90℃加热预处理后，分别酶解30、60、120 min。图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图4 不同酶解条件下制备的大豆7S蛋白胃蛋白酶酶解物的抗原性降低率

2.3 抗消化肽段的鉴定(见图5)

注：M为 Marker；1为大豆7S蛋白；2为80℃加热预处理10 min后，胰蛋白酶酶解10 min；3为80℃加热预处理10 min后，胃蛋白酶酶解10 min。图5 胰蛋白酶、胃蛋白酶的酶解物抗消化肽段的SDS-PAGE谱图

结合两种酶解方式的电泳结果以及抗原性来看，胰蛋白酶酶解物和胃蛋白酶酶解物仍具有一定的抗原性，虽然胰蛋白酶和胃蛋白酶的酶解位点不同，但是均在加热预处理再酶解后产生相同位置的新条带，推测可能是残留的抗消化肽段(20～25 kDa)引起的(图5中的I 、II)。为了确定这两种酶解条件下的新条带的相关信息，采用质谱鉴定抗消化肽段，结果见表2。

由表2可知，这两种酶解条件下的新条带均来源于β-伴大豆球蛋白的α亚基，发现虽然两种酶酶解位点不同，但产生的抗消化肽段来源相同，且α亚基是国际公认的致敏蛋白之一[20]，这解释了为何酶解后还存在致敏性。大豆过敏属于IgE介导的Ⅰ型超敏反应[21]，致敏原要保持完整的抗原决定簇才有致敏的可能性。

表2 抗消化肽段的质谱鉴定结果

3 结 论

本研究表明，加热和酶解联合处理能够显著增大β-伴大豆球蛋白的降解程度，β亚基消化程度得到极大提升，α亚基、α′亚基几乎完全被降解，在相同酶解时间下，胰蛋白酶的酶解速度快于胃蛋白酶。同时，加热和酶解联合处理能够有效地降低大豆7S蛋白的抗原性。单独加热处理，仅可使得蛋白结构松散，更多的酶解位点得到暴露，引起过敏反应的构象表位得到一定的破坏。而加热联合酶解处理能够大幅度降低β-伴大豆球蛋白的抗原性，蛋白展开的结构暴露的抗原表位更利于蛋白酶的破坏，其中胰蛋白酶的酶解效果优于胃蛋白酶，经80℃加热预处理10 min再经胰蛋白酶处理，大豆7S蛋白的抗原性降低了79.99%，而胃蛋白酶酶解条件下最多只降低了50.4%。另外，胰蛋白酶和胃蛋白酶经过加热预处理后再酶解，产生的相同相对分子质量位置的新条带，经蛋白鉴定后，均来自于β-伴大豆球蛋白的α亚基，为国际公认的致敏蛋白之一。此结果可为脱敏食品的研究提供一定的理论基础。