亚麻籽油对肥胖小鼠视网膜的保护作用研究

王 黎，石 蕊，雷 媛，戴思洋

(1.西安医学院 药学院，西安 710021； 2.陕西省人民医院 眼科，西安 710068)

糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，最终可导致不可逆的视力丧失，是威胁人们视觉健康的首要疾病[1]。肥胖是导致2型糖尿病发生的独立危险因素，脂肪的过度积累引起全身性炎症状态，进而导致骨骼肌葡萄糖摄入量减少和肝糖异生增加[2-3]。同时，肥胖是导致糖尿病患者并发DR的首要危险因素[4-5]，在视网膜微血管等组织中，肥胖引起的脂质代谢紊乱导致自由基生成增加[6]。而视网膜葡萄糖转运体1(GLUT1)不受胰岛素调控，高血糖时易转运进较其他组织更多的葡萄糖。脂质、自由基协同高糖导致视网膜中炎症因子的积累[7-8]，其中，血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的增多促使血管增殖性DR的发生[9]。

DR已被全球“视觉2020”行动列为“可避免盲”的攻克目标之一，但到目前为止，还未发现可显著遏制DR进展的行之有效的方法。多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)是一种存在于鱼油、橄榄油、玉米油等食用油中的多烯类脂肪酸。ω-3类PUFAs被证实对全身各系统具有抗炎活性，包括对视网膜的抗炎活性[10]。

亚麻籽油是重要的ω-3类PUFAs来源，其α-亚麻酸含量高达50%以上[11-12]。亚麻籽油还含有多酚类物质及脂溶性维生素E，多酚类物质能够抗氧化、清除自由基，维生素E是重要的类脂抗氧化剂。因此，可以推测，亚麻籽油的使用有望能够阻断上述”脂代谢紊乱-氧化应激压力与高糖-炎症-视网膜损伤”病理通路。然而，目前尚无亚麻籽油对DR干预作用的研究。因此，本文以视网膜中炎症因子IL-10及DR的主要成因VEGF为主要指标，研究含亚麻籽油的膳食对高脂饮食诱导的肥胖小鼠视网膜损伤进展的影响，阐述含亚麻籽油的膳食对DR的干预作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

健康雄性昆明种小鼠60只，4周龄，体重(21±4)g，购自成都达硕实验动物有限公司。小鼠自由摄食及饮水，分笼饲养于SPF级饲养环境，室温(22±2)℃，每日明暗时间各12 h，每周称量动物的体重。动物实验依据西安交通大学实验室动物准则实施。

1.1.2 试剂与仪器

小鼠基础饲料(颗粒型日粮维持饲料)，河南天驰实验动物饲料厂；精炼猪油(食品级)，临沂新程金锣肉制品集团有限公司；精炼亚麻籽油(食品级，加工工艺为压榨，质量等级为一级，标称α-亚麻酸含量52.6%)，上海嘉里食品工业有限公司；anti-IL-10与anti-VEGF抗体，圣克鲁斯生物技术；γ-生育酚标品 (纯度95%)，瑞士罗氏公司；拜安进血糖仪(国食药监械(进)字2014第2404310号)及拜安进配套试纸(葡萄糖脱氢酶法，国械注(进)20142405084)；胰岛素注射液(10 mL，400 U，使用前以生理盐水稀释)，江苏万邦生化医药集团有限责任公司；7890A型气相色谱仪，美国安捷伦公司；YZ5X型裂隙灯显微镜，苏州六六视觉科技股份有限公司；TDL-80-2B型离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 亚麻籽油中α-亚麻酸、多酚及维生素E含量测定[13-14]

测定亚麻籽油中α-亚麻酸含量时，以内标法定量；测定亚麻籽油中多酚含量时，以外标法定量，多酚含量以咖啡酸含量计；测定亚麻籽油中维生素E含量时，采用外标法定量。

1.2.2 实验膳食的制备

小鼠的实验膳食均依据 AIN-93G自行配制。将小鼠基础饲料(粗脂肪含量4%)以粉碎机粉碎，混匀后等分为3份：1份拌入猪油，使脂肪含量达到35%，作为高脂饲料；1份采用猪油与亚麻籽油各占50%的调和油拌入油脂，同样使脂肪含量达到35%，作为亚麻籽油饲料；1份不作调整，作为正常饲料。拌合均匀后捏制成鼠粮形状，烘箱烘干即得实验膳食，4℃储存备用。

1.2.3 动物实验

将小鼠随机分为2组，正常膳食组(SD组)及高脂膳食组(HD组)。SD组饲喂正常饲料，HD组饲喂高脂饲料，共喂养8周。每日称量投喂及剩余饲料，观察摄食情况，每周称量小鼠体重，观察体重变化情况。在8周结束后，测定小鼠的胰岛素抵抗情况，通过体重及胰岛素抵抗情况判定肥胖性糖尿病模型是否造模成功。将造模成功的小鼠随机再分为HD组和亚麻籽油组(FOD组)，HD组继续饲喂高脂饲料，FOD组饲喂亚麻籽油饲料。SD组继续饲喂正常饲料。继续饲喂8周后，处死全部小鼠，摘取双眼眼球。以眼科手术器械在放大镜下分离眼球各组织，自虹膜后切去前节部分，去除晶状体与玻璃体，使用镊子小心剥取视网膜并立即以液氮冷冻，于-80℃冻存。

1.2.4 小鼠的胰岛素抵抗测试[15-16]

将实验小鼠禁食8 h，腹腔内注射胰岛素(注射剂量1.5 U/kg)，注射后在0、10、20、30 min时在尾静脉取血，立即使用电子血糖仪测定血糖，绘制血糖随时间的变化曲线，计算血糖相对时间的平均下降率(KITT)。

1.2.5 视网膜组织中VEGF、IL-10水平的ELISA法检测[17]

将-80℃下冻存的视网膜组织取出，在预冷的PBS(0.01 mol/L,pH 7.0～7.2)中洗去血污，冰上加PBS研磨，反复冻融得匀浆液。用包被缓冲液(pH 9.6，0.05 mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液)稀释anti-IL-10、anti-VEGF，在96孔板上每孔加0.3 mL，4℃过夜。次日去除包被液，各孔用洗涤缓冲液(0.05% Tween20)洗涤3次。在各孔中加入稀释液(pH 7.4,0.02 mol/L Tris缓冲液)稀释的上述待测标本0.2 mL，同时加入阳性和阴性对照标本，在37℃放置90 min。去除液体后洗涤3次，加入VEGF、IL-10的酶标抗体0.2 mL，于37℃放置90 min。去除液体后洗涤3次，加入0.2 mL底物溶液(OPD)于各孔中，室温作用30 min，加终止剂2 mol/L H2SO4溶液0.05 mL。在酶标仪上读取450 nm下的吸光值，分析VEGF、IL-10水平。

2 结果与讨论

2.1 亚麻籽油中α-亚麻酸、多酚及维生素E含量

经测定本研究所使用的亚麻籽油中α-亚麻酸平均含量为53.59%，总多酚平均含量为0.097 mg/g，其主要生育酚异构体γ-生育酚平均含量为418.78 μg/g。

2.2 小鼠的体重变化及胰岛素抵抗情况(见表1)

表1 小鼠的体重变化及胰岛素抵抗情况

由表1可见： SD组及HD组小鼠在实验起始时，体重为(21±4) g，第8周时，SD组小鼠的体重增至(39±4) g，而HD组增至(53±5) g，HD组体重显著大于SD组(P<0.05)；SD组小鼠的血糖相对时间的平均下降率(KITT)为3.92%/min，而HD组仅为1.94%/min，HD组小鼠血糖对胰岛素注射的敏感度显著小于SD组(P<0.05)，说明HD组已出现明显的胰岛素抵抗。结合HD组体重及胰岛素抵抗情况数据，说明肥胖性糖尿病小鼠模型成功建立。

按1.2.3方法饲喂小鼠至第16周，SD组小鼠的KITT为3.25%/min, HD组仅为1.91%/min, HD组显著小于SD组(P<0.05)，且与其第8周时的数据相比无显著性差异(P>0.05)，说明HD组在第8周出现的胰岛素抵抗未改善；自第8周时从HD组分出饲喂含亚麻籽油膳食的FOD组在第16周时KITT为2.98%/min，相对SD组无显著性差异(P>0.05)，相对HD组第8周时的数据具有显著性差异(P<0.05)，说明该组小鼠在第8周出现的胰岛素抵抗已明显改善。

第16周时，SD组小鼠的体重增至(47.5±5.0)g，HD组增至(68.3±11.0)g，FOD组增至(66.4±8.0)g，HD组体重显著大于SD组(P<0.05)，但HD组与FOD组间体重无明显差异，说明饲喂亚麻籽油在未改善小鼠肥胖的情况下，改善了其糖尿病胰岛素抵抗情况。

2.3 小鼠视网膜组织中VEGF、IL-10的相对表达水平(见表2)

表2 第16周时小鼠视网膜组织中VEGF、IL-10相对表达水平

由表2可见：HD组小鼠视网膜组织中VEGF及IL-10水平均显著高于SD组(P<0.05)；FOD组小鼠视网膜组织中的VEGF及IL-10水平与SD组相比无显著性差异，相比HD组存在显著性差异(P<0.05)。

目前的研究表明，肥胖型糖尿病患者更易发生微血管并发症。叶守姣等[5]研究发现，合并肥胖的糖尿病患者的视网膜病变、糖尿病肾病、周围神经病变、下肢血管病变显著增多，而心脑血管病变则未增多。郑锦标等[4]对213例DR患者进行患病危险因素的调查分析发现，肥胖对DR的影响居首，其定义比数比(odds ratio)是第二位影响因素“饮酒”的3倍多。

肥胖型糖尿病患者更易发生微血管并发症的机制目前尚不十分清楚。目前的研究普遍认为，可能与肥胖导致的脂质代谢紊乱等多种因素有关[18]，并受到脂联素的调控[19-20]，而脂联素受ω-3类PUFAs 的调控[21]。这有可能是亚麻籽油中富含的ω-3 类PUFAs发挥抗视网膜损伤作用的途径之一。

脂质代谢紊乱导致的氧化应激压力可能是肥胖型糖尿病合并DR的另一原因。多酚类化合物丹酚酸A可以改善肥胖型糖尿病大鼠的视网膜病变[22]，这可能与其对抗氧化应激的作用有关。本研究测定了亚麻籽油中的多酚和维生素E的含量，亚麻籽油富含多酚及维生素E等抗氧化性类脂可能是其发挥抗DR作用的另一途径。

3 结 论

在连续8周饲喂高脂饲料后，小鼠出现明显的肥胖、胰岛素抵抗症状，肥胖性糖尿病小鼠造模成功。此时，若改变饲喂方式，以混合亚麻籽油膳食饲喂肥胖性糖尿病小鼠，8周后相对高脂膳食组，其肥胖状况未得到改善，但胰岛素抵抗状况明显改善，视网膜炎症因子IL-10、视网膜血管内皮生长因子VEGF水平明显降低。因此，含亚麻籽油膳食饲喂可以改善高脂膳食引起的肥胖小鼠的视网膜损伤。