复合蛋白酶水解黑豆粕制备多肽的工艺优化

潘进权，蒋 边，张恩舒，黎华艳

(岭南师范学院 生命科学与技术学院，广东 湛江 524048)

黑豆粕是黑豆榨取油脂后的副产物，含有丰富的蛋白质，含量达到40%左右；黑豆粕中蛋白质的氨基酸组成均衡，营养价值较高，是一类优质的植物蛋白资源[1]。长期以来，黑豆粕被广泛用作饲料蛋白原料，用来替代鱼粉[2]。但是黑豆粕中含有多种抗营养因子，如胰蛋白酶抑制因子、大豆抗原蛋白、寡糖等，这些抗营养因子不但阻碍了饲料中营养成分的消化、吸收和利用，而且也会对动物的生长发育和健康造成不良影响[3]。此外，黑豆粕的蛋白质分子是高度压缩折叠的，本身较难消化吸收，利用率较低[4-6]。因此，对黑豆粕进行改性加工，提高其蛋白资源的利用率至关重要。

目前，国内外对黑豆蛋白资源的研究大多集中在蛋白质的提取工艺方面[7-9]，而对黑豆蛋白的深加工及改性研究相对较少。已有的研究表明，蛋白质原料经水解得到的多肽混合物具有比原料蛋白及氨基酸混合物更优越的食品加工性能及营养价值[10-12]；而且多肽制品通常具有一定的生理保健功能，如抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力等[13-15]。因此，作为一种新型的氮素营养物质，多肽制品具有更广阔的使用空间。鉴于此，本研究提出了复合蛋白酶水解黑豆粕高效制备多肽的工艺路线，通过复合蛋白酶对黑豆粕蛋白质进行深度水解，制备酸溶性好、宜消化吸收的多肽制品，这样既克服了黑豆粕在营养上的不足，同时可赋予多肽制品一定的生理保健功能。研究结果将为黑豆粕蛋白资源的加工与利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黑豆粕(粗蛋白质含量为42.44%)，吉林省亿源生态产品有限公司。中性蛋白酶(116.2 U/mg)，诺维信酶制剂公司；木瓜蛋白酶(105.1 U/mg)，北京鼎国生物技术有限责任公司；米曲霉蛋白酶(254.4 U/mg)、桔青霉蛋白酶(182.4 U/mg)、微生物中性蛋白酶(214.1 U/mg)，实验室自制；胰蛋白酶(242.2 U/mg)，国药集团化学试剂有限公司；碱性蛋白酶(182.4 U/mg)，南京奥多福尼生物科技有限公司；以上蛋白酶酶活均按照 GB/T 23527—2009，采用Folin-酚法测定。其他试剂均为国产分析纯。

SKD-08S2红外智能消化炉，SKD-600自动凯氏定氮仪，HJ-2A数显恒温多头磁力搅拌器，PHS-3C数显pH计，L550低速离心机，FA3204B电子天平。

1.2 试验方法

1.2.1 蛋白酶水解黑豆粕的工艺流程

黑豆粕→粉碎过100目筛→配制黑豆粕溶液→调节pH→加入蛋白酶→保温水解→调节pH→沸水浴灭酶→离心分离→蛋白水解液。

操作要点：用蒸馏水配制蛋白质量浓度为30 g/L 的黑豆粕溶液，调节pH为8.0，按照4 000 U/g(以蛋白质量计，下同)的加酶量加入蛋白酶制剂，混匀后置于45℃水浴中保温水解4 h，期间通过滴加1 mol/L的NaOH溶液维持水解体系pH的稳定；水解结束后调节pH到4.5，然后将水解液置于沸水浴灭酶10 min，在4 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液，得到蛋白水解液。

1.2.2 多肽得率的测定

按照GB 5009.5—2016采用凯氏定氮法测定样品中蛋白质的质量浓度， 按照GB/T 22492—2008测定水解液中多肽的质量浓度。按下式计算多肽得率。

多肽得率=水解液中多肽的总量/原料蛋白质总量×100%

1.2.3 多肽的电泳分析

采用Tricine-SDS-PAGE电泳系统[16]，16.5%分离胶(添加分离胶体积10%的甘油)，10%夹层胶，4%浓缩胶。点样后30 V跑1 h后，待指示前沿到达分离胶上沿时，把电压调至90 V，恒压至电泳结束。

1.2.4 多肽与黑豆粕蛋白的氨基酸组成分析

参照GB 5009.124—2016测定多肽的氨基酸组成：5 mL蛋白水解液加入2 mol/L的三氯乙酸5 mL，充分混匀后静置10 min，然后于8 000 r/min离心10 min，收集上清液；取1 mL上清液(或0.3 g黑豆粕粉)于水解管内，加入15 mL 6 mol/L的盐酸，在110℃水解22 h，取水解后的样液利用氨基酸自动分析仪测定各种氨基酸的含量。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选

按照1.2.1所述方法，分别采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、微生物中性蛋白酶、米曲霉蛋白酶、桔青霉蛋白酶，在各蛋白酶适宜的条件下进行黑豆粕水解试验，通过测定各水解液的多肽得率比较不同蛋白酶对黑豆粕水解效果的差异，并由此确定适合黑豆粕水解的主要蛋白酶类型，结果如表1所示。

表1 不同蛋白酶对黑豆粕水解效果的比较

由表1可以看出：胰蛋白酶与碱性蛋白酶对黑豆粕的水解效果相对最好，其水解液的多肽得率显著高于其他几种蛋白酶，说明这两种蛋白酶的肽键选择性对黑豆粕蛋白的肽键组成及分布有较好的适应性；木瓜蛋白酶与中性蛋白酶对黑豆粕的水解能力较差，显示出较差的适应性。根据上述试验结果，可确定水解黑豆粕的主要蛋白酶为胰蛋白酶与碱性蛋白酶。

2.2 蛋白酶的复配

分别以胰蛋白酶或碱性蛋白酶与其他几种蛋白酶按酶活比1∶1配制复合蛋白酶液；按照1.2.1的方法进行水解试验，测定各水解液的多肽得率，比较不同复合蛋白酶对黑豆粕水解性能的差异，以及各蛋白酶之间的协同作用效果，由此确定黑豆粕水解的最佳复合蛋白酶组成，结果如表2所示。

表2 不同复合蛋白酶对黑豆粕水解效果的比较 %

由表2可以看出：碱性蛋白酶或胰蛋白酶与其他几种蛋白酶组成的复合蛋白酶对黑豆粕的水解效果显著优于单一蛋白酶的试验结果，这说明各蛋白酶之间存在一定的肽键互补性；胰蛋白酶、碱性蛋白酶与桔青霉蛋白酶三者之间表现出较强的协同作用效果；胰蛋白酶与米曲霉蛋白酶，碱性蛋白酶与微生物中性蛋白酶之间有较弱的协同作用效果。根据以上试验结果可以初步确定以碱性蛋白酶、胰蛋白酶及桔青霉蛋白酶三者来构建复合蛋白酶，其中碱性蛋白酶与胰蛋白酶作为复合蛋白酶的主酶，桔青霉蛋白酶作为辅助蛋白酶成分。

2.3 蛋白酶的复配比例

设计碱性蛋白酶与胰蛋白酶不同的酶活比进行复配配制复合蛋白酶，按照1.2.1的方法进行黑豆粕水解试验，测定各水解液的多肽得率，结果如表3所示。

表3 胰蛋白酶与碱性蛋白酶配比对黑豆粕水解效果的影响

由表3可知，胰蛋白酶与碱性蛋白酶配比对复合蛋白酶水解黑豆粕的效率有显著的影响。主酶中起主导作用的是碱性蛋白酶，适当加大碱性蛋白酶的比例可显著提高复合蛋白酶对黑豆粕的水解效率。根据试验结果可确定胰蛋白酶与碱性蛋白酶较合适的复配比例为1∶3。在固定主酶配比的前提下，分析了桔青霉蛋白酶添加比例对复合蛋白酶水解效率的影响，结果见表4。

表4 主酶与辅助酶配比对黑豆粕水解效果的影响

由表4可知，主酶与辅酶配比对复合蛋白酶水解黑豆粕的效果有显著的影响。主酶中添加适量的桔青霉蛋白酶可以显著提高复合蛋白酶的作用效果，主辅酶的适宜配比为2∶1。根据以上试验结果，经综合考虑确定了适合黑豆粕水解的最佳蛋白酶是由胰蛋白酶、碱性蛋白酶与桔青霉蛋白酶按照酶活比1∶3∶2配制而成的复合蛋白酶。此试验结果与文献报道的大豆蛋白水解最适复合蛋白酶的组成相类似[17]，说明这两种植物蛋白的结构及肽键组成较为接近。

2.4 水解工艺的单因素试验

2.4.1 底物蛋白质量浓度对水解工艺的影响

用蒸馏水配制黑豆粕溶液，使底物蛋白质量浓度分别为10、20、30、40、50、60、70 g/L，采用优化后的复合蛋白酶，按照1.2.1的方法进行水解试验，考察底物蛋白质量浓度对黑豆粕水解工艺的影响，结果如图1所示。

图1 底物蛋白质量浓度对黑豆粕水解工艺的影响

由图1可知：当水解体系的底物蛋白质量浓度较低时，多肽得率相对较高，说明黑豆粕中蛋白的溶出较充分，溶液中蛋白的水解较完全；随着水解体系中底物蛋白质量浓度的增加，多肽得率呈现下降趋势，尤其是当底物蛋白质量浓度超过40 g/L后下降趋势更显著，说明蛋白的水解程度降低了，水解不充分。这是由于随着体系底物蛋白质量浓度的增加，水解体系中多肽浓度随之增加，多肽类产物对蛋白酶的反馈抑制作用增强，从而导致水解体系中有效酶活降低；此外，水解体系的黏稠度会随着底物浓度的增加而迅速上升，蛋白从黑豆粕组织中溶出的速率减慢，从而降低了蛋白的水解效率。根据上述结果确定适宜的底物蛋白质量浓度为40 g/L。

2.4.2 加酶量对水解工艺的影响

采用优化后的复合蛋白酶，分别以500、1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000 U/g的加酶量，按照1.2.1的方法进行水解试验，考察加酶量对黑豆粕水解工艺的影响，结果如图2所示。

图2 加酶量对黑豆粕水解工艺的影响

由图2可知：加酶量对水解工艺有显著影响。当底物蛋白质量浓度为30 g/L时，随着加酶量的增加，多肽得率呈现不断上升的趋势；当加酶量达到6 000 U/g以上，多肽得率增长较缓慢，说明此时的加酶量相对于底物蛋白已趋于饱和。根据试验结果可初步确定适宜的加酶量在6 000 U/g左右。

2.4.3 pH对水解工艺的影响

采用优化后的复合蛋白酶，按照1.2.1的方法分别在pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的条件下进行水解试验，考察pH对黑豆粕水解工艺的影响，结果如图3所示。

图3 pH对黑豆粕水解工艺的影响

由图3可知，pH对多肽得率有较显著的影响。在弱酸性条件下多肽得率显著偏低。弱碱性的环境有利于蛋白水解及多肽得率的提高。这应该与复合蛋白酶在碱性条件下有最佳催化活性密切相关；另外，黑豆粕蛋白在碱性条件下有更好的水溶特性，碱性环境有助于黑豆粕蛋白的溶出以及在水溶液中的分散，更有利于蛋白与酶的结合及水解反应的发生。综合上述试验结果初步确定水解体系适宜的pH在10.0左右。

2.4.4 水解温度对水解工艺的影响

采用优化后的复合蛋白酶，按照1.2.1的方法分别在30、35、40、45、50、55、60、65℃的条件下进行水解试验，考察水解温度对黑豆粕水解工艺的影响，结果如图4所示。

图4 水解温度对黑豆粕水解工艺的影响

由图4可知，当水解温度低于55℃时，水解体系的多肽得率随着水解温度的升高而增加，说明黑豆粕蛋白的水解程度逐步上升，这是由于适当的升温可以提高蛋白酶的催化活性，有助于黑豆粕蛋白的溶出，提高溶液中底物蛋白的浓度，使蛋白水解更充分。当水解温度高于55℃之后，多肽得率随着水解温度的升高而迅速下降，这是由于高温导致了蛋白酶变性失活，水解体系中蛋白酶的有效活性降低，豆粕蛋白水解不完全。根据上述试验结果，可初步确定水解体系适宜的水解温度在55℃左右。

2.4.5 水解时间对水解工艺的影响

采用优化后的复合蛋白酶，按照1.2.1所述方法分别在水解0.5、1、2、3、4、5、6、7 h条件下进行水解试验，考察水解时间对黑豆粕水解工艺的影响，结果如图5所示。

图5 水解时间对黑豆粕水解工艺的影响

由图5可知：在水解的前1 h内，蛋白水解最为迅速，体系中多肽得率的增长速度最快；在水解的中期(1～5 h)，随着体系中底物蛋白浓度的降低，以及蛋白酶活性的下降，蛋白水解速度减慢，体系中多肽得率呈现缓慢的增长；在水解的后期(5 h以后)，水解体系的多肽得率基本趋于稳定，说明水解反应已基本终止。根据上述试验结果，可确定适宜的水解时间在6 h左右。

2.5 水解工艺的响应面试验

根据单因素试验，确定了加酶量、水解温度及pH对黑豆粕水解工艺有较显著影响。在固定底物蛋白质量浓度40 g/L、水解时间6 h的前提下，以多肽得率(Y)为响应值，运用Design Expert软件的Central Composite试验设计针对以上3个因素进行中心组合试验及响应面分析，响应面试验因素水平如表5所示，响应面试验设计及结果如表6所示。

表5 响应面试验因素水平

表6 响应面试验设计及结果

续表6

根据表6试验结果，以多肽得率为响应值，加酶量(A)、水解温度(B)和pH(C)为变量进行曲线拟合，可以构建变量与响应值之间的数学模型：Y=80.64+4.28A+0.89B-2.33C-0.88AB-0.29AC+0.71BC-3.30A2-8.32B2-2.82C2。

运用Design Expert软件对数学模型及表6中数据进行方差分析，结果如表7所示。

表7 响应面试验结果的方差分析

由表7可知，模型极显著(P<0.01)，模型的相关系数R2为0.996 8，模型的失拟项不显著(P=0.689 1>0.1)，由此说明以上模型对试验结果有非常高的拟合度，模型可用于对各因素取值范围内的试验结果进行预测及优化。对各因素项进行显著性分析，其结果显示加酶量(A)、水解温度(B)和pH(C)对黑豆粕水解工艺有极显著的影响，单一因素对多肽得率呈现非线性(二次项极显著)的相互关系；此外，因素A和B之是存在极显著的交互作用(P<0.01)，因素B和C之间存在显著的交互作用(P<0.05)。

运用Design Expert软件优化得到最优工艺条件为加酶量5 670 U/g、水解温度50℃、pH 9.55，在此条件下预测的最大响应值为82.60%。综合单因素试验及响应面试验结果可以确定复合蛋白酶水解黑豆粕的最佳工艺条件为：胰蛋白酶、碱性蛋白酶与桔青霉蛋白酶按酶活比1∶3∶2配制复合蛋白酶，加酶量5 670 U/g，底物蛋白质量浓度40 g/L，pH 9.55，水解温度50℃，水解时间6 h。在优化的工艺条件下进行了6次验证试验，多肽得率分别为82.78%、81.89%、82.34%、83.06%、82.58%、81.96%，平均值为82.44%，此结果与模型预测的最大响应值相接近，进一步验证了上述数学模型的可靠性。试验结果表明，优化后的复合蛋白酶及其水解黑豆粕工艺可实现黑豆粕蛋白的高效转化，其多肽得率远高于已有的文献报道结果[18]。

2.6 黑豆粕水解液的电泳分析

除水解时间外，用优化后的工艺条件进行复合蛋白酶水解黑豆粕试验，采用Tricine-SDS-PAGE电泳系统对黑豆粕水解液进行了分析，电泳图谱如图6所示。

由图6可以看出，复合酶对黑豆粕蛋白的水解程度较高，多肽的相对分子质量集中在7.8 kDa以下。比较b～e 4个泳道的条带分布及颜色深浅可以发现，随着水解时间的延长，水解液中大分子(10 kDa以上)片段的肽逐渐减少直至消失。然而中等相对分子质量(6 kDa左右)的肽并没有因此而增加，反而呈现出递减的趋势，说明水解液中有相当一部分肽是以更小相对分子质量(3.3 kDa以下)的形式存在。这部分肽因相对分子质量小，在电泳中扩散到电泳胶片以外，因此未能在电泳胶片上显色出来。另外，泳道d和e的条带情况基本一致，这说明5 h后黑豆粕蛋白的水解已基本结束，此结果与前述单因素试验结果相吻合。

注：a.超低相对分子质量Marker；b.水解0.5 h的样液；c.水解3 h的样液；d.水解5 h的样液；e.水解7 h的样液。

2.7 多肽的氨基酸组成

采用优化后的工艺条件进行复合蛋白酶水解黑豆粕试验，用氨基酸自动分析仪测定水解液中多肽的氨基酸组成，并与黑豆粕蛋白的氨基酸组成比较，结果如表8所示。

表8 黑豆粕蛋白及水解液中多肽的氨基酸组成

由表8可以看出：黑豆粕蛋白具有较好的营养价值，其含有动物体所需的17种氨基酸(因检测条件限制没能检测色氨酸)，8种必需氨基酸占氨基酸总量达到35%以上；对比黑豆粕蛋白与水解液中多肽的氨基酸组成可以看出，多肽的氨基酸组成与黑豆粕蛋白的氨基酸组成基本一致；水解后,仅有谷氨酸与苯丙氨酸占氨基酸总量的比例有较显著的增加,含硫氨基酸在水解中有少量的损失，其他几种氨基酸占氨基酸总量的比例变化均不显著。由此说明，经复合蛋白酶水解制备的多肽具有与黑豆粕蛋白相类似的营养价值。

3 结 论

为有效利用黑豆粕蛋白资源，考察了复合蛋白酶水解黑豆粕制备多肽的工艺路线。从蛋白酶的筛选入手，考察了不同蛋白酶对黑豆粕的水解效果差异。结果显示：胰蛋白酶对黑豆粕蛋白有最高的水解效率，其次是碱性蛋白酶；中性蛋白酶对黑豆粕蛋白的水解效率最低；胰蛋白酶、碱性蛋白酶与桔青霉蛋白酶三者间有较显著的协同作用，由三者配伍构建的复合蛋白酶的水解效率远高于单一蛋白酶的水解效率。通过复配比例优化确定了复合蛋白酶的最佳组成为胰蛋白酶、碱性蛋白酶与桔青霉蛋白酶按酶活比1∶3∶2的比例复配。采用单因素及响应面试验对复合蛋白酶水解黑豆粕的工艺条件进行了探究，确定最佳工艺条件为：复合蛋白酶加酶量5 670 U/g，底物蛋白质量浓度40 g/L，pH 9.55，水解温度50℃，水解时间6 h。在最佳工艺条件下，多肽得率达到82.44%。对水解液中多肽进行了电泳分析，结果发现水解液中多肽的相对分子质量均在7.8 kDa以下，大部分以小肽的形式存在，相对分子质量分布在3.3 kDa以下。说明优化的复合蛋白酶可实现黑豆粕蛋白的深度水解，将黑豆粕蛋白高效转化为小分子肽。对水解液中多肽的氨基酸组成进行了分析，结果显示，多肽具有与黑豆粕蛋白相似的氨基酸组成，营养价值较高。综合以上结果可以看出，采用优化后的复合蛋白酶水解黑豆粕高效制备多肽的工艺路线具有可行性。