超声辅助-分散液液微萃取/快速液相色谱-串联质谱法测定食用植物油中黄曲霉毒素

朱筱玲，赵淑娥，罗春丽，熊远珍

(1.江西省分析测试研究所，南昌 330029； 2.南昌大学 药学院，南昌 330006)

黄曲霉毒素(AFT)是由黄曲霉和寄生曲霉产生的化学结构类似的系列代谢产物[1]，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)是天然的三致性和免疫抑制毒性之首的剧毒物,摄入高含量AFB1食物的人或动物可能会导致肝癌甚至死亡[2]。食用植物油AFB1超标是因花生、玉米、大豆等原料霉变和生产、加工、运输、储藏等环节控制不当而受霉菌侵染所致[3]。AFT的耐高温性与稳定性使其很难被杀灭，用紫外线[4]、微波和光催化可解毒[5]，最新研究表明基因工程及拮抗菌有望抑制产毒菌株生长和毒素产生[6]。然而一级预防措施是制定限量标准，GB 2761—2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》中植物油脂AFB1限量为(除花生油、玉米油为20 μg/kg外)10 μg/kg。

检测AFT常用方法有薄层色谱法、酶联免疫吸附法[7]、高效液相色谱-荧光检测法[8-10]、液相色谱-质谱联用法[11-15]等。GB 5009.22—2016《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》均把以上方法列入其中。前3种方法操作烦琐、重现性差，还可能出现假阳性，难以准确定性定量。用免疫亲和柱净化结合液质联用技术可特异性提取和高灵敏度准确测定黄曲霉毒素[14-15]，但成本高、耗时长。近年纳米材料也用于食用油中的AFB1检测[16]。分散液液微萃取法(DLLME)始于环境水样分析前处理[17]，原理是将微升级萃取剂和分散剂的混合液注入萃取体系，在分散剂-样液相形成萃取剂微珠悬浮于样液相内，大大扩大萃取剂微珠和样液相接触面，使被测物转移非常迅速，数秒内达平衡而极大提高了萃取率和富集倍数。DLLME用于食品黄曲霉毒素检测所见不多[13,18],与国标方法相比省去净化、吹干富集等步骤。超声辅助(UA)有利于分散乳化使AFT萃取更完全。本文采用UA-DLLME技术，结合液质联用技术建立UA-DLLME/RRLC-MS/MS分析食用植物油4种黄曲霉毒素方法，具有简便、高效，准确度和精密度高的优点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

AFB1(1162-65-8)、AFB2(7220-81-7)、AFG1(1165-39-5)、AFG2(7241-98-7)标准溶液，质量浓度均为3 μg/mL，1 mL装，上海安谱科技公司；甲醇、乙腈、正己烷，色谱纯，德国Merck公司；乙醇、丙酮、石油醚(沸程60～90℃)，分析纯，西陇科学公司；乙酸铵、甲酸，色谱纯，欧盟；实验用水为屈臣氏饮用水，广州屈臣氏食品饮料公司。食用植物油为市场抽查的花生油、稻米油、米糠油、菜籽油和调和油样品。

6410B型三重四级杆串联质谱仪，配有1200SL快速液相色谱(RRLC)系统，美国Agilent公司；KQ5200DE超声波清洗器，江苏昆山市超声仪器有限公司；XH-B型涡旋混合器，江苏康健医疗用品公司；TDL-5-A型离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 混合标准溶液的配制

将AFB1、AFB2、AFG1、AFG2标准溶液(1 mL装)分别用乙腈定容至10 mL容量瓶中，4种储备液质量浓度均为0.3 μg/mL，4℃冰箱保存。取适量4种标准储备液用初始流动相稀释，配制成质量浓度分别为0.625、1.25、2.50、7.50、15.0、30.0 ng/mL的系列混合标准溶液。

1.2.2 液相色谱与质谱条件

1.2.2.1 液相色谱条件[12]

Luna C18(2)100 Å色谱柱(150 mm×2.0 mm，3 μm)；柱温30℃；进样量1 μL；流动相A相为乙腈，B相为5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)，0～1.0 min 80%～40% B，1.0～4.0 min 40% B，4.0～4.01 min 40%～80% B；流速0.3 mL/min。

1.2.2.2 质谱条件

电喷雾离子源，正离子扫描模式，干燥气温度为300℃，干燥气流速为10 L/min，毛细管电压为4 000 V，电喷雾压力为0.24 MPa。监测离子对、源內碎裂电压及碰撞气能量见表1。

表1 4种AFT的MRM扫描参数

1.2.3 样品前处理

称取1.0 g样品于塑料离心管中，加入2 mL石油醚溶解，涡旋混匀。再用1 mL乙腈-水(体积比8∶2)混合均匀，超声萃取2 min，静置分层后于4 000 r/min离心5 min，吸取底层溶液(为避免上机溶液夹带油脂污染仪器，再用适量石油醚分两次反萃取，弃去上层石油醚)经0.22 μm滤膜过滤后上机。由于没有购买到标准质控样，每一定量批次样品选用其中阴性样品添加已知质量浓度的4种AFT溶液作为质控。

2 结果与讨论

2.1 线性关系考察

配制的4种AFT的质量浓度范围为0.625～30.0 ng/mL，以质谱仪峰面积的响应值(y)对AFT质量浓度(x)进行线性回归，其回归方程和相关系数见表2。由表2可知，4种AFT在0.625～30.0 ng/mL范围内的线性良好，线性相关系数(R2)均大于0.998。

表2 线性关系和线性范围

2.2 前处理方法的优化

根据文献不确定度评估分析[19]，对前处理中影响目标物提取效率的因素进行逐项优化(包括分散剂的种类和体积、萃取剂的种类和体积、萃取时间、离心转速和离心时间等)。

2.2.1 分散剂、萃取剂及提取方式的筛选

黄曲霉毒素微溶于水，不溶于石油醚、正己烷和乙醚等非极性溶剂，易溶于甲醇、乙腈、丙酮等有机溶剂。油样黏稠需使用分散剂稀释，使萃取剂液滴更好地扩散至样品与被测物接触。比较了石油醚、正己烷和乙醚3种分散剂及涡旋与超声两种提取方式对AFT回收率的影响，结果见图1。

由图1可知，乙醚为分散剂时AFT回收率低，石油醚和正己烷为分散剂时AFT回收率较高，超声提取效果略优于涡旋。理论上石油醚极性与正己烷相似，为己烷和辛烷等系列烷烃混合物，两者与油脂互溶性好，利于分散，考虑成本选石油醚作分散剂。超声波对油脂萃取分离的强化作用主要源于其空化效应，而超声空化又引起了湍动效应、聚能效应、微扰效应和界面效应，因而超声波可强化萃取分离过程的传质速率和效果，从而有利于目标物提取。实验中观察超声易形成乳化而增加了溶剂渗透性，配合DLLME过程可提高萃取效率，使目标物易于转入萃取剂而净化样品基质。

图1 不同分散剂超声与涡旋提取对AFT回收率的影响

DLLME用的萃取剂应对分析物有良好的亲和性，且有良好的色谱行为。筛选了4种萃取剂(甲醇、乙腈、乙醇和丙酮)，发现使用乙醇和丙酮为萃取剂时无法分层，实验中止。使用甲醇-水或乙腈-水为分散剂可增加其在样品中的渗透力，提高萃取效率。分别考察4种比例(体积比分别为8∶2、7∶3、6∶4、5∶5)的甲醇-水和乙腈-水对AFT回收率的影响，结果见图2。由图2可知，乙腈-水(体积比8∶2)的AFT整体回收率较高，因此选择乙腈-水(体积比8∶2)为萃取剂。

图2 不同比例乙腈-水和甲醇-水为萃取剂对AFT回收率的影响

2.2.2 分散剂体积和萃取剂体积对萃取效果的影响

比较了分散剂体积分别为0、1、2、3、4 mL的萃取效果，结果见图3。由图3可知，不用分散剂因油样黏度大难较完全萃取，加入1 mL分散剂明显优化，2 mL的萃取效果比3、4 mL要好。在分散剂增加的过程可能会出现反萃取，且3、4 mL与萃取剂体积(微升级)相差悬殊，不利于溶液分层得到上机液，所以选择2 mL作为分散剂体积。

比较了萃取剂体积500、800、1 000、1 200 μL的萃取效果，结果见图4。由图4可知，随着萃取剂体积增大萃取效果先增加，但萃取剂体积为1 200 μL时，萃取效果反而降低。可能随萃取体积增大富集倍数降低，故选择萃取剂体积为1 000 μL。

图3 分散剂体积对AFT回收率的影响

图4 萃取剂体积对AFT回收率的影响

2.2.3 萃取时间对萃取效果的影响

在石油醚作分散剂(2 mL)、乙腈-水(体积比8∶2)为萃取剂(1 000 μL)等相同条件下，不同超声辅助萃取时间(2、5、10、15 min)的效果比较见图5。

图5 超声辅助萃取时间对AFT回收率的影响

由图5可知，超声2 min时4种黄曲霉毒素回收率均超过85%，延长萃取时间至5 min未见回收率提高，延长至10 min略有降低，再至15 min又稍有增加，原因是随萃取时间延长会出现反复的反萃取。故选择超声辅助萃取2 min，既省时又满足要求。

2.2.4 离心转速和离心时间对萃取效果的影响

离心可进一步加速溶液分离，提高萃取效率。考察了离心转速和离心时间分别为2 000、3 000、4 000、5 000 r/min和3、5、8、10 min时的AFT回收率情况，结果见图6、图7。

图6 离心转速对AFT回收率的影响

图7 离心时间对AFT回收率的影响

由图6、图7可知，离心转速4 000 r/min和离心时间5 min为最佳。

2.3 样品的加标回收率

采用本方法，用阴性样品加标做回收率实验，在2.5、15.0、30.0 ng/mL 3个质量浓度水平上进行加标(n=6),同时采用GB 5009.22—2016第一法外标法，用阴性样品加标做回收率实验，在30.0 ng/mL质量浓度水平上进行加标(n=6)，结果见表3。由表3可知，采用本方法，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2回收率在88.2%～101.5%之间，在30.0 ng/mL质量浓度水平上回收率分别为100.8%、101.0%、99.7%、98.9%。采用国标方法AFB1、AFB2、AFG1、AFG2在30.0 ng/mL质量浓度水平上加标回收率分别为95.1%、94.8%、93.9%、92.9%，本方法在回收率方面优于国标第一法外标法，其差异具有统计学意义。且本方法样品用量少，萃取试剂用量少，时间短，不需要柱净化和蒸发浓缩。受条件限制没有用同位素内标法进行校正。

表3 加标回收率实验结果(n=6)

2.4 精密度实验

以阴性样品基质标准为例，同一标准样品重复进样9次，4种AFT的RSD为3.1%～3.3%。

2.5 基质效应

用初始流动相稀释的标准溶液与用阴性花生油和稻米油样作基质配制标准溶液的峰面积做比值，4种AFT的比值在0.95～1.09之间，说明基质效应可忽略。因此，本实验不采取基质标准溶液作校正。

2.6 样品测定

用本方法对市场监督抽查的近百批次花生油、米糠油、稻米油、菜籽油和食用调和油进行检测，其中一批次阳性花生油样的总离子流图见图8。结果检出花生油AFB1和AFB2最高一批次含量分别高达76.8 μg/kg和23.9 μg/kg，AFB1超过限量值近3倍。原因是花生最易在生长、收获、储运过程中霉变产毒，再用此花生加工制油时造成黄曲霉毒素污染。其他油样均未检出黄曲霉毒素阳性。

图8 标准和阳性花生油样品AFT的总离子流图

3 结 论

建立了UA-DLLME/RRLC-MS/MS同时测定食用植物油中4种黄曲霉毒素的方法。该方法加标回收率为88.2%～101.5%，相对标准偏差小于3.3%，回收率优于国标第一法外标法，且样品用量少、萃取剂微量、萃取时间短、不需前处理柱净化和蒸发浓缩，具有简单、快速、经济、准确度和精密度高且环境友好等优点，适合批量油样定性、定量分析，具有实际参考价值。本研究不足之处是提取物可能残留少许油脂，对色谱柱和仪器污染造成隐患。除了上机前样液增加脱脂步骤外，建议在色谱柱前加装预柱。