亚临界r134a-丁烷萃取菜籽饼中脂质微量成分工艺研究

郭婷婷，万楚筠，黄凤洪

(1.中国农业科学院 油料作物研究所，武汉 430062； 2.油料油脂加工技术国家地方联合工程实验室，武汉 430062；3.农业部油料加工重点实验室，武汉 430062)

菜籽饼为油菜籽低温压榨后获得的加工副产物，2018年我国菜籽饼供给量达1 000万t。研究发现，菜籽饼中除了含12%～15%残油[1]外，还含有微量的营养成分，如Canolol、生育酚、植物甾醇等。Canolol由芥子酸脱羧而成，占总游离酚酸的70%～85%[2]，是油菜籽中主要的多酚类化合物之一，具有良好的抗氧化、抗诱变性能[3]。生育酚是一种天然的强抗氧化剂，能有效抑制脂质氧化。油菜籽中的生育酚主要为α-生育酚和γ-生育酚，且γ-生育酚的含量相对较高[4]。植物甾醇具有降低胆固醇、预防动脉粥样硬化和增强免疫调节等生理功能。谷甾醇是油菜籽中主要的植物甾醇，其次是菜油甾醇和菜籽甾醇[5]。

亚临界流体萃取技术是近年发展起来的一种新型提取分离技术，其在常温或者较低温度下即可进行，很大程度上保护了易挥发性和热敏性成分不被破坏[6]。目前，亚临界流体萃取技术已被用于多酚[7]、黄酮[8]、虾青素[9]等天然活性成分的萃取及多环芳烃[10]等风险因子的监测。本文以亚临界1，1，1，2-四氟乙烷(r134a)-丁烷混合溶剂为萃取剂，考察r134a与丁烷配比对亚临界萃取菜籽饼中Canolol、生育酚和植物甾醇的影响，并采用正交实验优化工艺条件，以期为提高菜籽饼利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菜籽饼，由中双11号双低油菜籽低温压榨所得，水分和残油分别为4.80%和12.79%；5α-胆甾醇、正己烷、甲醇、乙醇、氢氧化钾、N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷(BSTFA+TMCS)、正丁烷(纯度99.90%)、1,1,1,2-四氟乙烷(r134a，纯度99.5%)，均为分析纯；正己烷、异丙醇、乙酸、甲醇，均为色谱纯。

亚临界流体萃取装置，中国农业科学院油料作物研究所定制；Avanti J-26离心机，赛默飞世尔科技有限公司；GX-25型多功能粉碎机；BS-11水浴摇床，韩国JeioTech公司；Agilent 6890N气相色谱；Acquity超高效液相色谱，美国Waters公司；LC-6AD液相色谱，日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 亚临界r134a-丁烷萃取菜籽饼中脂质微量成分

将菜籽饼粉粹，过40～60目筛。称取300 g菜籽饼粉于萃取袋中，系口后置于亚临界流体萃取装置的萃取罐中，加盖密封；开启真空泵使萃取罐、分离罐和计量罐中压力降至-0.01 MPa。按照料液比1∶8加入r134a-丁烷混合溶剂，对物料进行静态萃取。萃取结束后，打开萃取罐与分离罐连接阀门，将萃取液导入分离罐。开启压缩机进行减压和溶剂回收，当萃取罐中压力降至0.15 MPa以下时，同时开真空泵，直至三罐压力降为-0.01 MPa脱溶结束。破真空，分别从分离罐和萃取罐中收集萃取油和粕。萃取油于8 000 r/min离心10 min，取上层油4℃保存待检测。

1.2.2 微量成分的测定

1.2.2.1 Canolol测定

参照Yang等[11]方法并做部分修改。称取1.25 g待测样(精确到0.000 1 g)，加入1.5 mL正己烷和1.5 mL 80%甲醇溶液。在振动混合器上萃取5 min，然后于5 000 r/min离心10 min。保留下层液，上清液重复萃取3次，合并3次萃取液混匀。用0.22 μm滤膜过滤，滤液用于UPLC分析。UPLC分析条件：Waters Acquity BEH Shield RP18色谱柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；流动相A为2%乙酸水溶液，流动相B为100%甲醇，梯度洗脱程序为5%～25% B(7.40 min)、25%～29% B(2.67 min)、29%～36% B(6.66 min)、36%～45% B(6.67 min)、45%～65% B(2 min)、65%～5%B(10 min)、5% B(4.6 min)；流速0.21 mL/min；柱温30℃；检测波长280 nm；进样量3 μL。

1.2.2.2 生育酚测定

参照AOCS Official Method Ce 8-89并做部分修改。称取约2 g待测样(精确到0.000 1 g)于25 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，旋涡混匀，过0.22 μm滤膜，滤液用于HPLC分析。HPLC分析条件：色谱柱为硅胶柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为正相，正己烷-异丙醇(体积比99.5∶0.5)；流速1 mL/min；检测波长292 nm(α-生育酚)和298 nm(γ-生育酚)；进样量20 μL。

1.2.2.3 植物甾醇测定

参照Xie等[12]方法并做部分修改。称取样品200 mg(精确到0.000 1 g)于50 mL离心管内，加入0.5 mL 5α-胆甾醇溶液(0.5 mg/mL)，室温下超声5 min。加入10 mL 2 mol/L氢氧化钾乙醇溶液，60℃水浴摇床反应60 min。取出后置于振动混合器上振摇2 min，冷却后加入4 mL水和5 mL正己烷，萃取2 min，于5 000 r/min离心3 min，收集上层液。向下层液中加5 mL正己烷，萃取3 min，于5 000 r/min离心5 min。合并2次上层液，加入1.5 g无水硫酸钠脱水，取5 mL提取液于10 mL样品瓶中，在80℃烘箱中蒸发溶液。加入100 μL BSTFA+TMCS，于105℃反应15 min。取出冷却至室温后，加入1 mL正己烷进行GC分析。GC分析条件：DB-5HT 色谱柱(30 m×0.22 mm×0.1 μm)；进样口、检测器温度320℃；载气为氦气，流速2 mL/min；分流比25∶1；程序升温条件为60℃保持1 min，以40℃/min升至310℃，保持10 min；进样量1 μL。

1.2.3 微量成分萃取量的计算

萃取量=c×m1/m2

式中：c为微量成分在萃取油中的含量，mg/100 g；m1为萃取油质量，g；m2为菜籽饼质量，g。

2 结果与分析

2.1 r134a与丁烷质量比对萃取菜籽饼脂质微量成分的影响

在亚临界混合溶剂萃取过程中，固定萃取温度为35℃，萃取时间为30 min，研究r134a与丁烷质量比对萃取油中微量成分Canolol、植物甾醇、生育酚萃取量的影响，结果如图1～图3所示。

由图1可见，随着混合溶剂中r134a比例的降低，Canolol萃取量呈先增大后减少的趋势，当r134a与丁烷质量比为6∶3时，Canolol萃取量达到最大值，为1.77 mg/100 g。由图2可见，r134a与丁烷质量比对菜籽饼中α-生育酚、γ-生育酚和总生育酚萃取量的影响具有相似的趋势，具体表现为当r134a与丁烷质量比由6∶1增加到6∶3时，α-生育酚、γ-生育酚和总生育酚萃取量迅速上升，之后趋于平缓。由图3可见，菜籽甾醇、菜油甾醇、谷甾醇及总甾醇萃取量随着混合溶剂中r134a比例的降低而逐渐增大，且增长率逐渐减小。

图1 r134a与丁烷质量比对Canolol萃取量的影响

图2 r134a与丁烷质量比对生育酚萃取量的影响

图3 r134a与丁烷质量比对植物甾醇萃取量的影响

不同r134a与丁烷质量比对亚临界流体萃取菜籽饼中微量成分的不同影响主要是由混合溶剂对各微量成分的溶解性差异造成的。Hildebrand等[13]提出溶解度参数可用来表征物质之间相互溶解性，其定义为液体内聚能密度的平方根。在此基础上，Hansen[14]建立了三维溶解度参数体系，即汉森溶解度参数(HSP)。物质间相互作用力主要有原子色散力、分子偶极力和电子交换氢键力。HSP表征物质分子极性的相对大小，分子极性(Xp)可表示为HSP中分子偶极力分量(permanent dipole forces，δp)和电子交换氢键力分量(hydrogen bonding，δh)平方和与总溶解度参数(δt)平方之商[15]。万楚筠[16]进一步计算并确定了r134a、丁烷Xp值分别为0.7和0，CanololXp值为0.5，而生育酚、植物甾醇Xp值约为0.2和0.15。5种物质中r134a分子极性最强，而丁烷分子极性最弱。混合溶剂中r134a所占比例极高或极低都会阻碍各微量成分的溶出，只有当二者以适当比例混合才有助于提高微量成分的萃取量。

2.2 正交实验

在实际应用中，通常设定萃取温度为25～45℃，萃取时间为10～50 min。采用L9(34)正交表，以r134a与丁烷质量比、萃取时间、萃取温度为自变量，以Canolol、总生育酚、总植物甾醇萃取量为评价指标，对亚临界混合溶剂萃取菜籽饼中脂质微量成分工艺条件进行优化。正交实验因素水平见表1，正交实验设计及结果见表2，方差分析见表3。

表1 正交实验因素水平

表2 正交实验设计及结果

表3 方差分析

由表2、表3可见，r134a与丁烷质量比、萃取时间、萃取温度对亚临界萃取菜籽饼中脂质微量成分Canolol、生育酚和植物甾醇均有极显著性影响(P<0.000 1)。以Canolol、总生育酚和总植物甾醇萃取量为评价指标，各因素的影响顺序均为r134a与丁烷质量比>萃取温度>萃取时间，最佳工艺条件均为A2C3B2，即r134a与丁烷质量比6∶3、萃取温度45℃、萃取时间30 min。在最佳工艺条件下，Canolol、总生育酚和总植物甾醇萃取量分别为2.43、9.71、89.17 mg/100 g。

3 结 论

采用亚临界r134a-丁烷混合溶剂萃取菜籽饼中微量成分Canolol、生育酚和植物甾醇，通过正交实验优化得到的最优萃取条件为：r134a与丁烷质量比6∶3，萃取温度45℃，萃取时间30 min。在最优萃取条件下，Canolol萃取量为2.43 mg/100 g，总生育酚萃取量为9.71 mg/100 g，总植物甾醇萃取量为89.17 mg/100 g。