栀子油对对乙酰氨基酚致小鼠急性肝损伤的保护作用

张俊逸，罗光明,2，柴华文，刘培培，朱梓豪

(1.江西中医药大学 药学院，南昌 330004； 2.江西中医药大学 中药资源与民族药研究中心,南昌 330004)

对乙酰氨基酚是一种治疗普通及流行性感冒的乙酰苯胺类解热镇痛药，因其对发热疼痛疗效好且副作用小而被广泛用于临床，短期低剂量使用不会对肝脏代谢造成影响，但大剂量服用对乙酰氨基酚或多种含对乙酰氨基酚的药物联合服用均会引起肝脏代谢有毒物质的积累，进而导致细胞损伤、炎症发生的药源性肝损伤[1]。

栀子来源于茜草科植物栀子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果实，性苦、味寒，有泻火除烦、凉血解毒的功效，主要含有环烯醚萜类、有机酸类和栀子黄色素等成分[2-3]，具有极高的药用价值。栀子油占栀子果实的13%左右[4]。国内外药理研究表明，栀子油具有镇静、提高记忆力、抗氧化、保肝等作用[5-7]。本实验采用对乙酰氨基酚建立药物性肝损伤模型，探讨栀子油对对乙酰氨基酚所致小鼠急性肝损伤的保护机制，为栀子油保肝作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF级KM雄性小鼠，体重16～20 g ，共72只，由山东省实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK(鲁)20140007，于江西中医药大学实验大楼动物房饲养，自由进食进水，适应3 d，动物房温度25～28℃、湿度35%～55%。

1.1.2 原料与试剂

栀子，购自江西省九江市湖口县顺昌栀子药材基地，经江西中医药大学中药资源学科罗光明教授鉴定为茜草科植物栀子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果实。

丙氨酸氨基转移酶(ALT，批号20171011)、天门冬氨酸转移酶(AST，批号20171007)、白蛋白(ALB，批号20171014)、还原型谷胱甘肽(GSH，批号20171028)、超氧化物歧化酶(SOD，批号20170615)、丙二醛(MDA，批号20170610)试剂盒，苏木素-伊红染液(批号20170428)，南京建成生物工程研究所；联苯双酯滴丸(生产批号 170914，每丸1.5 mg)，浙江万邦药业股份有限公司；对乙酰氨基酚片(生产批号170412,每片0.5 g)，广东环球制药有限公司；吐温-80。

1.1.3 仪器与设备

Sartorius bs224s 电子分析天平；DY89-II 电动匀浆机；UV-1800型紫外可见光分光光度计，岛津公司(日本)；Multiskan Go酶标仪，赛默飞世尔科技公司(上海)；Allegra64R 高速冷冻离心机，Beckman 公司(USA)；JW-3021HR高速冷冻离心机；DFY-400摇摆式中药粉碎机；TKY-BMB型石蜡包埋机及专用包埋冷台；Vortex-Genie 2涡旋混合器，美国Scientific Industries公司；KQ3200DB型数控超声波清洗器；HH-4数显恒温水浴锅；RE-5299旋转蒸发器；XHF-D 匀浆机。

1.2 实验方法

1.2.1 供试药物的提取

取干燥后的栀子，经中药粉碎机粉碎后，过20目筛，加5倍量的石油醚，于85℃索氏提取3 h后，旋蒸回收石油醚，得栀子油，4℃冰箱保存备用。

1.2.2 动物分组及给药

将72只KM小鼠随机分为6组，分别为正常对照组，模型对照组，联苯双酯阳性对照组(0.2 g/kg)，栀子油低剂量(0.3 g/kg)、中剂量(0.6 g/kg)、高剂量(1.2 g/kg)组。本实验用0.5%吐温-80溶液溶解联苯双酯和栀子油。正常对照组和模型对照组正常饮食、饮水，其余各组每天给药1次，连续7 d，末次给药后1 h，除正常对照组腹腔注射无菌生理盐水外，其余各组小鼠一次性腹腔注射450 mg/kg对乙酰氨基酚制备急性肝损伤模型，禁食不禁水，24 h后摘除小鼠眼球取血，测定血清生化指标，取出肝脏用于肝脏生化指标测定和肝组织病理学检查。

1.2.3 指标测定

全血3 000 r/min离心10 min，取上层血清，检测 ALT、AST和ALB水平；取0.1 g肝脏组织，用4℃生理盐水制成10%的肝匀浆，离心，取上清液，检测SOD、MDA、GSH水平。各指标的检测均按其试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 肝脏组织学分析

取各组小鼠肝脏相同部位的肝组织，用10%甲醛溶液固定，之后进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片展片、HE染色，在置光镜下观察肝组织的损伤程度。

1.2.5 数据分析

2 结果与讨论

2.1 栀子油对急性肝损伤小鼠血清 ALT、AST和ALB水平的影响(见表1)

从表1可以看出，与正常组相比，模型组小鼠血清ALT和AST水平显著升高(p<0.001)，ALB水平显著降低(p<0.001)，说明急性药物性肝损伤模型建造成功。与模型组相比：联苯双酯组小鼠血清中ALT和AST水平均显著下降(p<0.001)，ALB水平显著升高(p<0.001)；栀子油中、高剂量组小鼠血清中ALT和AST水平均具有显著性降低趋势(p<0.01、p<0.001)，ALB水平显著降低(p<0.001)，且高剂量组优于中剂量组，呈剂量依赖性。表明栀子油对对乙酰氨基酚所致小鼠急性肝损伤具有一定的保护作用。

表1 栀子油对小鼠血清 ALT、AST和ALB水平的影响

2.2 栀子油对急性肝损伤小鼠肝脏GSH、SOD和MDA水平的影响(见表2)

从表2可以看出，与正常组比较，模型组小鼠肝组织产生了明显的氧化应激反应，表现在MDA水平显著提高(p<0.001)，GSH和SOD活力显著降低(p<0.001)。与模型组相比，联苯双酯组GSH和SOD活力显著升高(p<0.001)；栀子油中、高剂量组MDA 水平显著降低(p<0.001)，GSH和SOD活力显著升高(p<0.05、p<0.01、p<0.001)，改善程度高剂量组优于中、低剂量组，呈剂量依赖性。

表2 栀子油对小鼠肝脏GSH、SOD和MDA水平的影响

2.3 肝脏病理学检查(见图1)

图1 小鼠肝组织扫描电镜图

从图1可以看出，正常组小鼠肝组织细胞排列整齐，围绕中央静脉呈辐射状且形态正常。模型组小鼠肝小叶及汇管区细胞可以看到明显浸润及肿胀现象，中央静脉周围细胞出现空泡和灶状坏死。联苯双酯组小鼠肝细胞则出现明显改善，肿胀及弥散情况减少，趋于健康。栀子油各剂量组细胞坏死情况均已得到改观，炎性细胞浸润现象减弱，细胞排列趋于整齐，说明栀子油对肝损伤组织具有明显的保护作用。

2.4 讨论

药物性肝损伤是指药物使用过程中对机体肝脏造成的损伤，轻度损伤在停药后会慢慢恢复，重则会危及生命，所以药物性肝损伤对药物临床研发及应用有着密切的影响[8]。对乙酰氨基酚导致的氧化应激反应是造成急性肝损伤的主要原因[9]。血清中ALT、AST的水平是评价肝损伤程度的敏感指标[10]，大剂量使用对乙酰氨基酚可导致ALT、AST水平在1～3 h内升高[11]，实验中灌胃栀子油后，小鼠ALT和AST水平显著降低，说明栀子油在一定程度上降低了对乙酰氨基酚对肝细胞膜的损害。ALB是一种具有抗氧化和损伤修复功能的蛋白，小鼠灌胃栀子油后ALB的水平升高说明栀子油可以促进ALB的分泌与合成，进而提高肝细胞自我修复能力。GSH是一种广泛存在于机体内的抗氧化酶，具有高效清除脂质过氧化物的作用[12]。部分对乙酰氨基酚进入肝脏结合细胞色素P450产生大量中间代谢产物N-乙酰对苯醌亚胺(NAPQI)，该产物有毒性，可与肝脏中谷胱甘肽(GSH)结合并代谢出体外[13]。栀子油可提高GSH水平进而减轻肝损伤的程度。SOD是机体清除自由基的特异性超氧化物歧化酶，SOD活力的降低直接表明机体内自由基的增加[14]。MDA是脂质过氧化反应的重要产物，可引起一系列的交联反应，并会引起细胞损伤，其水平高低间接反映机体细胞受自由基攻击的程度[15]。相比模型组，使用栀子油后小鼠血清中SOD活力明显上升、MDA水平显著下降，表明栀子油可通过清除氧自由基来产生对肝细胞的保护作用。

3 结 论

本实验中通过对小鼠腹腔注射高剂量对乙酰氨基酚溶液，导致小鼠出现肝脏损伤现象，探讨栀子油对对乙酰氨基酚致小鼠急性肝损伤的保护作用。结果表明，栀子油高、中剂量组小鼠血清中ALT和AST的水平均有明显下降，ALB、GSH和SOD活性提高，MDA水平降低，肝组织切片显示肝组织变性及坏死等病理症状明显改善。说明栀子油具有清除自由基、抑制脂质过氧化反应、防止细胞膜受损、减轻细胞肿胀坏死的效果，对药物所致肝损伤具有显著保护作用。综上所述，栀子油对对乙酰氨基酚所致肝损伤具有一定的保护作用，其保护机制与提高抗氧化酶体系活力、抑制脂质过氧化、维持肝细胞膜正常形态有关。