响应面法优化酶法提取鳄鱼油工艺研究

董合磊，吴颖峰，刘 佳，马小宏，肖红梅

(1.南京农业大学 食品科技学院，国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，南京 210095；2.如皋市海宏皮革制品有限公司，江苏 如皋 226500)

鳄鱼是一种古老的肉食性卵生脊椎类两栖爬行动物，属爬行纲(Repitilia)、鳄目(Crocodilia)，主要生活在温带及热带地区[1]。我国自1993年开始引进、养殖鳄鱼。2005年，国家林业局批准人工养殖尼罗鳄、湾鳄、暹罗鳄3种鳄鱼列入首批54种可商业经营利用野生动物名录。随着人工养殖技术的日益完善，养殖地域已经由南方各省扩大到北京等北部地区, 人工养殖鳄鱼规模不断扩大，鳄鱼养殖量越来越大[2]。然而人工养殖鳄鱼依然主要用于鳄鱼皮革制品，鳄鱼其余部位如血、骨、肉、脂肪等开发力度不够，造成了较大的资源浪费，影响了鳄鱼业的健康发展。

鳄鱼内脏周围与尾部肌肉间贮藏大量贮脂，是鳄鱼油提取的优质原材料[2]。鳄鱼油已被证实具有防冻伤、抗菌消炎、愈合烧伤疤痕的功效[3-4]，已被用于化妆品与防冻伤等药品[5]。科学研究发现，鳄鱼油脂肪酸多达24种，且不饱和脂肪酸含量较高；鳄鱼油中含有EPA和DHA。因此，鳄鱼油在保健品方面也有一定的开发前景。

鱼油的生产工艺主要包括蒸煮法、压榨法、稀碱水解法、酶法和超临界流体萃取法等。酶法是利用蛋白酶对蛋白质进行水解，破坏蛋白质结构，进而破坏蛋白质与脂肪的结合，使油脂释放出来。酶法反应条件温和，所得油脂品质较高，并且蛋白酶价格较低，酶解产物还能进一步加工用于饲料工业[6-12]。目前关于鳄鱼油提取工艺研究较少[13-14]，有关酶法提取鳄鱼油相关研究更少。

本研究以人工养殖暹罗鳄贮脂为主要原料，采用酶法提取鳄鱼油，以提取率为评价指标，利用单因素实验与响应面法对鳄鱼油的提取工艺进行优化，同时对鳄鱼油进行理化指标和脂肪酸组成分析，以期为鳄鱼油工业化生产及深加工提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

鳄鱼躯干和尾部，苏州市奥新鳄鱼开发有限公司泰兴分公司提供。碱性蛋白酶(5×104U/g)、中性蛋白酶(5×104U/g)、复合蛋白酶(10×104U/g)、木瓜蛋白酶(10×104U/g)、风味蛋白酶(1.5×104U/g) ，食品级，北京索莱宝科技有限公司提供；其他试剂均为分析纯。

JRJ-200型绞肉机；BL-220H分析天平，岛津(上海)实验器材有限公司；磁力搅拌水浴锅；恒温水浴锅；Avanti J-E型高速冷冻离心机，美国Beckman Counter公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料前处理

剔取鳄鱼躯干和尾部中的贮脂，使用4 mm孔板绞肉机绞碎，将绞碎的鳄鱼贮脂糜放入真空包装袋，-20℃冷冻贮藏备用。

1.2.2 酶法提取鳄鱼油工艺流程

冷冻鳄鱼贮脂糜→解冻→取20 g鳄鱼贮脂糜→按一定料液比加入蒸馏水→加入一定量蛋白酶→水浴搅拌加热一定时间→90℃水浴灭酶10 min→5 000 r/min离心15 min→称重→贮藏。

提取率=鳄鱼油质量/(鳄鱼贮脂糜质量×鳄鱼贮脂中粗脂肪含量)×100%

鳄鱼贮脂中粗脂肪含量测定:参照 GB 5009.6—2016，采用索氏抽提法测定其含量为82.6%。

1.2.3 蛋白酶筛选实验

因为不同的蛋白酶的酶切位点不同，对鳄鱼贮脂提取鳄鱼油的水解作用也各不相同，需要通过筛选蛋白酶得到最佳的实验用酶。本实验选择中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶和风味蛋白酶作为实验用酶，并参考各蛋白酶的使用说明确定其最适实验温度(见表1)。在该温度下，固定料液比为1∶1、酶添加量为1%，分别加入5种蛋白酶，酶解3 h，以鳄鱼油提取率作为选择蛋白酶的依据，同时用空白对照实验作对比。

表1 蛋白酶最适实验温度

1.2.4 鳄鱼油理化性质的测定

酸价，参照GB 5009.229—2016；过氧化值，参照GB 5009.227—2016；碘值，参照GB/T 5532—2008；水分及挥发物含量，参照GB 5009.236—2016；不溶性杂质，参照GB/T 15688—2008。

1.2.5 脂肪酸组成分析

鳄鱼油脂肪酸组成参照GB 5009.168—2016第三法，由江苏华测品标检测认证技术有限公司测定。

1.2.6 数据处理

实验数据每组重复3次取平均值，图表采用Excel 2013进行处理绘制，使用SAS 8.0进行单因素方差分析，响应面实验设计与分析采用Design-Expert 8.0软件。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶种类的筛选(见图1)

注：字母不同代表存在显著性差异(P<0. 05)。

图1 不同蛋白酶对鳄鱼油提取率的影响

由图1可知，空白组提取率最低，仅为50.22%。加入蛋白酶后，鳄鱼油提取率显著上升。蛋白酶水解能力的不同是因为不同蛋白酶对于肽键的专一性有所不同，所以提取率也有一定的差异[12]。实验结果表明碱性蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶的提取率结果相近，没有显著性差异(P>0.05)。提取率最高的为中性蛋白酶，鳄鱼油提取率达到76.02%，且中性蛋白酶价格相比其他酶更低。综合提取率和经济因素，选择中性蛋白酶。

2.2 单因素实验

2.2.1 提取时间对提取率的影响

以鳄鱼贮脂为原料，提取时间分别设定1、2、3、4、5 h 5个水平，其他条件固定为酶添加量1%、料液比 1∶1、提取温度50℃，研究提取时间对鳄鱼油提取率的影响，结果见图2。

图2 提取时间对鳄鱼油提取率的影响

由图2可知，随着提取时间的延长，鳄鱼油提取率不断升高，超过3 h后，鳄鱼油提取率略微下降，总体趋势平缓，这与衣美艳[6]、陆剑锋[8]等的研究结果一致。提取时间过长可能会使得鳄鱼油的品质降低，因为鳄鱼油中含有大量不饱和脂肪酸，暴露在空气中时间越长，会造成鳄鱼油中不饱和脂肪酸氧化，使鳄鱼油色泽加深。因此，选择最适的提取时间为3 h。

2.2.2 料液比对提取率的影响

以鳄鱼贮脂为原料，料液比分别设定1∶0、1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2.5个水平，其他条件固定为酶添加量1%、提取温度50℃、提取时间3 h，研究料液比对鳄鱼油提取率的影响，结果见图3。

图3 料液比对鳄鱼油提取率的影响

由图3可知，当不加水时，鳄鱼油提取率最低，这是因为不加水时，底物与酶接触不均匀，酶反应不充分。当料液比为1∶0.5时，鳄鱼油提取率最大。当料液比继续增大，鳄鱼油提取率越来越低，这是因为加水过多之后，酶分子和原料的接触概率降低，鳄鱼油提取率下降。因此，选择最适的料液比为1∶0.5。

2.2.3 酶添加量对提取率的影响

以鳄鱼贮脂为原料，酶添加量分别设定0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25% 5个水平，其他条件固定为提取时间3 h、料液比1∶0.5、提取温度50℃，研究酶添加量对鳄鱼油提取率的影响，结果见图4。

图4 酶添加量对鳄鱼油提取率的影响

由图4可知，鳄鱼油提取率随着酶添加量的增加呈现先上升后下降的趋势，与李梦凡[10]、陶轶松[11]等研究结果相近。当酶添加量为0.5%时，鳄鱼油提取率最高，随后逐渐降低，可能原因是酶添加量过高会使酶相互影响，使得酶对底物的水解作用降低。同时从成本方面考虑，选择最适的酶添加量为0.5%。

2.2.4 提取温度对提取率的影响

以鳄鱼贮脂为原料，提取温度分别设定40、45、50、55、60℃ 5个水平，其他条件固定为提取时间3 h、料液比1∶0.5、酶添加量0.5%，研究提取温度对鳄鱼油提取率的影响，结果见图5。

图5 提取温度对鳄鱼油提取率的影响

由图5可知，鳄鱼油提取率随着提取温度的升高而升高，提取温度较低时，鳄鱼贮脂无法完全酶解，提取率较低。当提取温度达到55℃时鳄鱼油提取率最高，之后随着提取温度升高鳄鱼油提取率降低。因为酶促反应容易受到温度的影响，且原理十分复杂，升高温度可能会加速分子的运动，也会对酶活性、底物和反应速度产生一定影响[15]。因此，选择最适提取温度为55℃。

2.3 响应面优化实验

2.3.1 响应面实验设计及结果

在单因素实验基础上，将提取时间固定为3 h，以提取温度(A)、料液比(B)、酶添加量(C)为因素，鳄鱼油提取率(Y)为指标，采用响应面实验确定酶法提取鳄鱼油的最优工艺条件。响应面实验因素水平编码见表2，响应面实验设计及结果见表3，方差分析如表4所示。

表2 响应面实验因素水平编码

表3 响应面实验设计及结果

通过Design-Expert 软件对表3中得到的鳄鱼油提取率数据进行二次多元回归拟合，得到二次多元回归方程为∶Y=87.36-1.94A-0.49B-2.50C+1.39AB+2.21AC+0.14BC-8.76A2-4.99B2-1.73C2。

表4 方差分析

注：*为差异显著 (P<0.05);**为差异极显著(P<0.01) 。

2.3.2 验证实验

通过该模型可以得到鳄鱼油最佳提取工艺条件为提取温度53.86℃、料液比1∶0.45、酶添加量0.28%，在此条件下鳄鱼油提取率为88.69%。为了实际工艺的方便，设置提取温度54℃、料液比1∶0.45、酶添加量0.3%，进行3次平行实验，鳄鱼油提取率的平均值为87.42%，与预测值基本相符。可见，该模型能够很好地预测酶法提取鳄鱼油的提取率，对鳄鱼油的实际工业生产具有一定参考价值。

2.4 鳄鱼油的理化性质(见表5)

表5 酶法提取鳄鱼油的理化性质

由表5可知：最佳工艺条件下提取的鳄鱼油呈浅黄色，略浑浊，具有鳄鱼油的特殊风味；鳄鱼油的酸价、过氧化值等指标都达到SC/T 3502—2016中一级粗鱼油标准；碘值(I)为148.47 g/100 g，可知鳄鱼油中不饱和脂肪酸含量丰富；不溶性杂质为0.45%，接近标准值，因为酶法提取过程中会产生一些蛋白质、胆固醇及色素等非油脂成分，这些杂质成分不仅会影响鳄鱼油的稳定性，也会影响鳄鱼油的进一步加工利用，因此可以通过进一步的精炼工艺提高鳄鱼油的质量，达到商业或者工业的目的。

2.5 鳄鱼油的脂肪酸组成(见表6)

表6 酶法提取鳄鱼油脂肪酸组成及相对含量 %

由表6可知，鳄鱼油中共检出32种脂肪酸，主要由C10～C24脂肪酸组成。鳄鱼油中饱和脂肪酸(SFA)含量为40.96%，主要为棕榈酸。不饱和脂肪酸(UFA)含量为58.57%，其中单不饱和脂肪酸(MUFA)占39.50%，主要为油酸，多不饱和脂肪酸(PUFA)占19.07%，主要为亚油酸，EPA与DHA总量为2.42%。酶法提取鳄鱼油的脂肪酸种类及EPA与DHA的含量均高于林珈好等[13]使用超临界CO2流体萃取法和干法熬制提取的鳄鱼油和李慧等[14]使用淡碱水解法提取的鳄鱼油，可能原因是提取方法或者原料不同影响鳄鱼油脂肪酸组成。鳄鱼油不饱和脂肪酸含量丰富，脂肪酸组成合理，属于优质的动物油脂。

3 结 论

以鳄鱼贮脂为原料，采用单因素实验结合响应面法对酶法提取鳄鱼油工艺条件进行优化，获得的鳄鱼油最佳提取工艺条件为中性蛋白酶添加量0.3%、料液比1∶0.45、提取温度54℃、提取时间3 h，在此条件下鳄鱼油提取率为87.42%。所得鳄鱼油产品外观呈浅黄色，略浑浊，具有鳄鱼油特殊风味，无酸败味，酸价、过氧化值等达到SC/T 3502—2016一级粗鱼油标准。鳄鱼油含有32种脂肪酸，其中饱和脂肪酸含量为40.96%，不饱和脂肪酸含量为58.57%，EPA和DHA总量为2.42%，表明鳄鱼油是一种具有较高营养品质的油脂。