10个菊花品种花粉生活力测定和贮藏方法研究

李亚军 黄河 牛雅静 李霞

摘要：[目的]筛选菊花花粉离体培养生活力测定的最佳培养基配方，探究花粉贮藏的最适温度和耐贮藏时间，并挑选出较耐贮藏的菊花品种，为菊花新品种选育和种质资源保存提供参考。[方法]以10个菊花品种盛花期花粉为试验材料，通过离体萌发测定法筛选菊花花粉萌发最适培养基，以该培养基测定花粉在4℃、-20℃和-80℃3种温度下进行60d或120d贮藏周期的生活力变化趋势观测，每隔15d取样检测1次;对贮藏120d的花粉进行授粉，统计结实率。[结果]培养基为ME₃+200g·L^-1PEG4000+6g·L^-1琼脂的处理，10种花粉都能萌发，且萌发率较其他培养基有显著差异;花粉贮藏60d后，所有花粉生活力均下降，其中‘5‘52‘64和‘854个品种花粉生活力下降较缓慢;4种花粉贮藏120d后，在-80℃贮藏的花粉生活力较高，花粉授粉后均能够结实，且品种‘5花粉授粉结实率最高，平均每个授粉花序结实8粒。[结论]花粉萌发培养基、植物品种基因型、贮藏温度和贮藏时间都会影响菊花花粉生活力。本文研究表明，菊花花粉最适贮藏温度为-80℃，品种‘5花粉可贮藏120d保持较高的授粉结实率，在杂交育种中可优先考虑。

关键词：菊花，花粉生活力，贮藏，授粉

中图分类号：S682.1+1文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2020）03-0295-08

0 引言

（研究意义）花粉是植物遗传信息的载体和交流工具，花粉贮藏是保存种质资源最简洁、高效的途径。在杂交育种工作中，花粉贮藏能够解决亲本花期不遇和远距离杂交问题，打破杂交亲本的空间和时间隔离。菊花（Chrysanthemum X morifolium Ramat.）是菊科菊属植物，在世界各地园艺造景中广泛应用，杂交育种是培育菊花新品种的主要手段。因而探讨菊花花粉最佳贮藏条件对于解决菊花近缘属间杂交以及品种间杂交所面临的花期不遇或远距离杂交等问题具有重要意义，同时在使用贮存花粉之前，选择合适的方法对花粉生活力进行测定，可确保选择了最优花粉进行人工授粉而得到性状优良的后代。（前人研究进展）不同物种最适花粉贮藏条件差异较大，且同一物种花粉贮藏时间不同，最适温度不同。如在月季、杜鹃花、接骨木等观赏植物中发现，低温干燥贮藏有利于延长花粉寿命;对海棠花粉和梅花花粉的研究发现，4℃是其花粉贮藏的最适温度;而对大白花杜鹃花粉贮藏生活力的研究发现，花粉贮藏30d以内时，-80℃条件下贮藏花粉生活力最高，而贮藏30d以上时，-16℃条件下贮藏花粉生活力最高。此外，快速准确测定不同品种花粉生活力，可为正确选择杂交组合提供重要的参考依据，也是保证杂交育种工作顺利进行的关键。花粉生活力测定方法有染色法、活体萌发法、离体萌发法以及田间杂交授粉等方法，其中田间杂交授粉法和离体萌发法分别是定性测定和定量测定花粉生活力的有效方法，而离体萌发培养基的组分对花粉萌发也具有重要影响。（本研究切人点）关于菊花花粉贮藏方法已有研究，但研究的贮藏周期较短，并缺少相应的授粉结实率的验证。（拟解决的关键问题）本研究以课题组自育的10个不同基因型菊花品种花粉为试验材料，設置不同花粉萌发培养基和贮藏温度，进行120d贮藏周期内花粉生活力的测定，并通过田间杂交授粉进一步验证贮藏温度对花粉生活力的影响。探究菊花花粉萌发的最佳培养基，适合菊花花粉贮藏的温度及适宜的贮藏时间，并寻找出10个菊花品种中较耐贮藏的品种，为菊花种质资源的保存及杂交育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料

试验材料为课题组通过荷兰引进的Time小菊系列与中国传统菊花杂交所获得的10个优良菊花品种：‘5、‘16、‘22、‘30、‘45、‘52、‘64、‘85、‘132、‘317（图1）。该10个菊花品种观赏性状较好，但自然花期偏晚（表1），因此会与花期早的菊花品种出现花期不遇现象。2018年11月于各品种于盛花期晴天上午10：00～12：00时，在北京植物园宿根花卉园菊花圃内用毛笔将花粉扫至2mL离心管中并带回实验室进行贮藏和花粉生活力测定。

1.2花粉生活力测定

1.2.1 最佳花粉萌发培养基筛选 蔗糖和硼酸对花粉的萌发和花粉管的伸长有重要作用，聚乙二醇（PEG）能够促进菊花花粉对蔗糖和硼的吸收。本试验共设7种花粉离体萌发培养基：①50g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸;②100g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸;③150g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸;④200g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸;⑤ME3+6g·L^-1琼脂;⑥ME₃+200g·L^-1蔗糖+6g·L^-1琼脂;⑦ME₃+200g·L^-1PEG4000+6g·L^-1琼脂。其中ME3培养基配方参考Widrle-chner等的配方，7种培养基pH为5.8～6.0.

1.2.2离体萌发測定花粉萌发率 花粉萌发率是衡量花粉生活力的主要标志。取配制好的7种液体培养基50uL滴于载玻片上，取50uL蒸馏水滴人凹玻片凹槽内，然后将花粉均匀撒播在液体培养基表面，载玻片向内翻转盖到凹玻片上，保证花粉处在均衡的环境中。将凹玻片放人铺有湿润滤纸的培养皿中，放人25℃恒温箱中培养2h，在40倍显微镜下观察花粉萌发情况，萌发的花粉管长度超过花粉直径则为萌发。每个处理重复3次，每重复随机选取3个视野观察，每个视野的花粉总数大于50粒，统计花粉粒总数和已萌发花粉粒总数。花粉萌发率=（已萌发的花粉粒数量/花粉粒总数量）×100%，取3个视野平均值作为花粉萌发率。

1.3贮藏条件设置

1.3.1花粉耐贮藏品种筛选 采集10个菊花品种盛花期花粉，并用2mL试管分装成小份进行贮藏。测定10个品种花粉原始生活力和60d贮藏周期后花粉生活力，比较不同品种花粉生活力变化情况，筛选出生活力较高的菊花品种。之后继续贮藏60d，比较贮藏周期120d后田间授粉结实率，筛选出花粉最耐贮藏品种。

1.3.2 贮藏溫度和贮藏时间对花粉生活力的影响将60d贮藏周期后筛选出的花粉继续贮藏在4℃、20℃、-80℃条件下，每隔15d测定1次花粉生活力，继续测定60d，观察花粉在120d贮藏周期内不同温度下不同贮藏时间段的生活力变化趋势，得到花粉生活力维持在较高状态且下降缓慢的临界贮藏时间，以及在长期贮藏情况下的最佳贮藏温度。同时在贮藏120d后，比较不同贮藏温度下花粉的授粉结实率，进一步验证菊花花粉贮藏的最适温度。

1.4 田间杂交授粉

选取生长健壮，自然花期较早且具有较高观赏性的菊花品种‘45作母本，通过花期调控使其在2019年3月开花;取在3种温度下贮藏120d的贮藏花粉，以及经过花期调控于2019年3月开花的相对应品种的新鲜花粉分别作父本。根据Huang等对菊花舌状花发育级别的划分，选取舌状花微微展开的S3级别花序进行剪辦、去雄和套袋。剪辦5～6d后，雌蕊成熟伸出花冠筒呈“Y”字形并伴有光泽，用毛笔蘸取采集的新鲜花粉和贮藏花粉分别涂抹于柱头上进行授粉。每个杂交组合选择10个花序授粉，每个花序授粉3～5次。2个月后采集干枯花序净种，通过比较结实率进一步探索适合菊花花粉贮藏的温度和耐贮藏的品种。

1.5 数据分析

用Excel软件和SPSS软件对测定数据进行处理及多重比较。

2结果与分析

2.1 最佳菊花花粉萌发培养基的筛选

试验选取了7种含有不同成分、可能适合菊花花粉离体萌发的培养基，通过测定10个菊花品种花粉在7种培养基上的萌发率，确定最适合菊花花粉萌发的培养基。

由表2可知，以50g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸、100g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸和ME₃+6g·L^-1琼脂作为培养基进行花粉离体萌发测定时，10个菊花品种花粉萌发率全都为0;而150g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸、200g·L^-1蔗糖/0.6g·L^-1硼酸、ME₃+200g·L^-1蔗糖+6g·L^-1琼脂以及ME₃+200g·L^-1PEG 4000+6g·L^-1脂作为花粉离体萌发培养基时，10个菊花品种花粉都有一定萌发率。说明低浓度蔗糖不适合菊花花粉萌发，较高浓度的蔗糖（>150g·L^-1）能够促进花粉萌发，且单独的ME3培养基不能促进花粉萌发。进行方差分析和多重比较，结果表明以7号培养基为花粉萌发培养基时，品种‘5、‘45、‘132的花粉萌发率最高，且与其他培养基上的花粉萌发率有显著差异;7号、6号和4号培养基中，品种‘162‘22‘30‘5‘64和‘317的花粉萌发率无显著差异，但在7号培养基中花粉萌发率最高。说明在ME₃基础上添加适当浓度PEG能够提高菊花花粉萌发率。因此选择7号培养基，即ME₃+200g·L^-1PEG 4000+6g·L^-1琼脂培养基作为离体萌发法测定菊花花粉生活力的最佳培养基。

2.2 不同菊花品种花粉生活力的比较

花粉原始生活力对花粉贮藏寿命有较大影响，而原始生活力除了受花粉采集时间、植株开花状态，当天气候状况等外界因素影响外，也因品种的不同而表现出较大差异。由表3可知，在试验的10个菊花品种花粉中，品种‘5的花粉原始生活力以及贮藏60d后生活力与其他花粉相比均有显著差异，且生活力最高，4℃、-20℃、-80℃贮藏60d后花粉萌发率分别为3.51%、3.61%、3.86%;另外9个品种的花粉在贮藏60d后生活力排名由高到低依次为‘85、‘16、‘22、‘52、‘132、‘64、‘45、‘30‘317。由图2可知，10个菊花品种花粉在3种温度下贮藏60d后生活力下降值从小到大依次为‘45、‘85、‘132、‘22、‘64、‘30、‘5、‘52、‘16‘317。综合考虑10个小菊品种相关性状，花粉原始生活力及贮藏60d后花粉生活力下降值，最终选择‘5、‘52、‘64和‘85这4个品种的花粉进行120d贮藏周期内的最佳贮藏温度筛选。

2.3 不同贮藏温度及天数对菊花花粉生活力的影响

分别将在4℃、-20℃、-80℃ 3种温度下贮藏120d的品种‘5、‘52‘64和‘85花粉在ME₃+200g·L^-1PEG 4000+6g·L^-1琼脂的培养基上进行萌发率测定。由表3、4可以看出，随着贮藏时间的延长，无论贮藏在哪种温度下，4种花粉生活力都会逐渐降低。其中貯藏在-20℃的花粉生活力与贮藏在4℃花粉生活力相比，大部分有显著差异，‘52花粉在贮藏60、75d时，-20℃贮藏与4℃贮藏的花粉生活力差异不显著;贮藏在80"C的4种花粉生活力与贮藏在-2℃和4℃的花粉生活力相比，在每一个贮藏时间内均有显著差异，说明-80℃更适合4种花粉的贮藏。在-80℃贮藏温度下，‘5花粉和‘85花粉在贮藏1-30d时花粉生活力无显著差异，‘52花粉和‘64花粉在贮藏1-60d内均有显著差异，在贮藏60-75d时差异不显著。综上，在进行菊花花粉贮藏时，选择-80℃贮藏，且贮藏周期在30d内，能够保持花粉具有较高的生活力。

2.4 杂交授粉比较不同品种和贮藏温度对花粉生活力的影响

杂交授粉法基本原理是根据果实和种子的形成情况判断花粉生活力，该方法能够更加真实客观地反映花粉生活力。为了进一步探索贮藏温度对菊花花粉生活力的影响，并筛选出耐贮藏菊花品种，将在3种温度下贮藏了120d的4个品种贮藏花粉和新鲜花粉分别进行杂交授粉试验，经过2个月得到杂交种子。表5为新鲜花粉做父本的授粉结果，表6为贮藏花粉做父本的授粉结果。

通过对比表中数据可知，贮藏花粉授粉后所得种子数明显低于新鲜花粉授粉所得种子数，说明花粉经过一段时间贮藏后，花粉生活力会下降。品种‘5花粉经-80℃贮藏120d后，依然能够结实，结实率显著高于‘52花粉、‘64花粉和‘85花粉。4种花粉在4℃条件下贮藏120d后都不能结实;在-20℃条件下贮藏后，只有品种‘5花粉授粉能够结实，其他3种花粉均无活性;在-80℃条件下贮藏后，4种花粉授粉都能够结实。综上可以看出，在经过120d贮藏后，品种‘5花粉依然有较高授粉结实率，是最耐贮藏品种;在4℃贮藏环境菊花花粉全部丧失生活力，在-20℃贮藏环境仅部分耐贮藏品种花粉可保持生活力，在-80℃贮藏环境大部分品种花粉均具有生活力，杂交授粉后能够正常结实，说明-80℃更适合菊花花粉的长期贮藏。

3 讨论与结论

3.1 离体萌发培养基对花粉生活力的影响

花粉是植物的雄配子体，是植物遗传信息的载体和交流工具，花粉生活力的测定和贮藏条件的研究对于种质资源的保存和育种工作的开展具有重要意义。离体萌发法是测定大多数植物花粉生活力的常用方法，蔗糖、硼酸和钙等微量元素是花粉离体萌发培养基的主要成分，但对不同植物所需要的浓度可能是不同的。玫瑰、牡丹等植物花粉萌发最适蔗糖质量浓度为100～150g·L^-1，文冠果花粉萌发培养基最适蔗糖质量浓度为150g·L^-1，花粉萌发率达到91.08%。在本研究中发现，在只添加蔗糖和硼酸的培养基中，200g·L^-1蔗糖质量浓度更有利于菊花花粉萌发。但蔗糖培养液对同属于菊属的南京野菊、毛华菊和几种栽培小菊花粉萌发均没有显著效果，说明蔗糖对不同种或不同品种植物作用不同，因而在测定植物花粉生活力时，需要先筛选出适合该种花粉萌发的最佳培养基，以使测定结果更准确。

PEG能够使花粉内膜结构发生变化，使膜的通透性提高，从而促进花粉萌发和花粉管生长。在本研究中，10个菊花品种花粉在ME₃+200g·L^-1PEG4000+6g·L^-1琼脂培养基上均有相对较高的萌发率，且高于200g·L^-1蔗糖+0.6g·L^-1硼酸、ME₃+200g·L^-1蔗糖+6g·L^-1琼脂，而花粉在单独的ME₃培养基上萌发率为0，说明PEG能够促进菊花花粉萌发。有研究发现在PEG基础上添加一定量的蔗糖能显著促进花粉萌发，但在二者的共同作用下，菊花花粉的萌发率是否大于单独PEG或蔗糖对花粉萌发的作用，以及二者的最佳浓度配比是多少，都值得进一步研究。

3.2 贮藏环境对花粉生活力的影响

影响花粉生活力的因素除了花粉自身遗传特性外，还有温度、湿度、光照、辐射等环境因素，温度和湿度是影响花粉贮藏寿命的主要因素。一般来说，植物花粉在低温下贮藏寿命更长，能保持较高的花粉生活力，且温度越低，花粉生活力下降越缓慢。例如聚石斛花粉在-20℃冷冻湿润、-20℃冷冻干燥、4℃冷藏湿润、4℃冷藏干燥4种条件下贮藏90d后，花粉生活力依次为21.7%、6.4%、1.4%和0.0%，无论是干燥还是湿润条件下，-20℃条件下贮藏花粉生活力都要明显高于4℃。在斑叶堇菜的研究中发现，花粉最佳贮藏条件为-80℃，在贮藏360d后，花粉萌发率仍达到40.50%。王涛等也曾对菊花花粉的贮藏条件进行研究，将菊花花粉分别以干燥和湿润2种状态贮藏在4℃、-20℃和-80℃条件下，发现水分和温度是影响菊花花粉贮藏寿命的2个重要因素，菊花花粉适合湿润贮藏，且-80℃更有利于菊花花粉的贮藏，但该研究仅探讨了60d贮藏周期内菊花花粉的贮藏温度，未进行更长周期的贮藏研究。本研究将10个菊花品种花粉分别贮藏在4℃、-20℃和-80℃条件下，并分别进行了60和120d贮藏周期研究，发现无论是短期贮藏还是长期贮藏，-80℃贮藏条件下，花粉生活力均高于其他贮藏条件下花粉生活力。同时，本研究也发现30d是菊花花粉贮藏时间节点，30d后花粉生活力均下降明显，因此若进行短期贮藏，在30d内使用花粉可获得较好的效果。但如果贮藏温度继续降低，花粉生活力是否会继续升高，花粉贮藏时间节点是否能够延长还有待进一步讨论。

此外，并不是在所有植物中，低温都更有利于花粉的贮藏，如对海棠花花粉的研究，发现最适贮藏条件是4℃;周婷等发现朱顶红‘苹果花品种花粉最适贮藏条件是4℃+干燥剂，90d后依然有较高的活性;刘颖等在对梅花花粉最适贮藏温度的研究中，将梅花花粉分别贮藏在4℃、-20℃、-40℃、-80℃4种温度条件下，发现最适贮藏温度为4℃，温度过低导致细胞脱水，反而不利于梅花花粉贮藏。说明对于不同种植物来说，花粉贮藏最适温度不同，冷冻贮藏并不适合所有植物。

综上所述，ME₃+200g·L^-1PEG 4000+6g·L^-1瓊脂是本研究中菊花花粉离体萌发的最佳培养基，而在PEG基础上添加一定量的蔗糖是否能够进一步提高花粉萌发率有待进一步研究。4℃、-20℃、-80℃ 3种贮藏温度相比，-80℃更适合菊花花粉贮藏，能够使菊花花粉保持相对较高的生活力，可以考虑作为菊花远距离杂交以及解决亲本花期不遇时进行花粉贮藏的最适温度。在贮藏过程中，菊花花粉生活力均随着贮藏时间延长而下降，30d内花粉生活力差异不显著，因而最好在30d内完成授粉以提高结实率。品种‘5花粉在-80℃贮藏120d后授粉依然能够结实，在杂交育种亲本选择时可优先考虑。