西藏小型猪毛乳头细胞的分离与培养

罗 洋，杜 华，鞠 英，王 洁，龙朝钦，高 剑，刘海燕

毛乳头细胞在毛囊的发育及周期性生长调控中起重要作用。要阐明毛乳头细胞对调节毛囊生长和发育的机制，必须从毛乳头细胞自身分泌的生物活性成分着手[1]。我们在建立人毛乳头细胞体外培养模型基础上，应用低传代人毛乳头细胞的培养上清制成条件培养基，发现其在体外有明显的生物学活性[2]，并将毛乳头细胞条件培养液制成冻干粉，初步应用于脱发患者的治疗，发现其有确切的治疗作用[3,4]。但人毛乳头细胞来源有限，制约其进一步研究，拟用猪毛乳头细胞替代人毛乳头细胞，希望能研究出人毛乳头细胞的替代细胞。本研究应用西藏小型猪毛乳头细胞进行分离与培养，观察其培养条件和细胞生物行为，为进一步分析和研究猪毛乳头细胞生长活性蛋白奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 DMEM 培养基（低糖）、分离酶、Ⅳ型胶原酶（Sigma 公司），D-Hanks 液、Hanks 液、新生小牛血清（Hyclone 公司），Hepes（Boehringer Mannheim 公司），胰蛋白酶（华美生物工程公司）。完全培养基以DMEM 培养基为基础，其主要成分的终浓度分别为：1 000 ml DMEM 液中含2.4 g Hepes，0.3 g L-谷氨酰胺，10 万U /L 青霉素，10 万U /L 链霉素，调整pH 值至7.3 左右，使用前加入小牛血清至浓度为15%。

1.1.2 组织来源 2 月龄西藏小型猪背部皮肤。

1.2 实验方法

1.2.1 猪毛乳头细胞的分离 在西藏小型猪背部无菌条件下取一直径5 cm 左右全层皮肤，在无菌环境中进行下列操作：①在超净台上将已处理好的猪皮在不锈钢肾形弯盘中用75%乙醇渍泡20 min，75%乙醇棉球擦洗2 遍，然后以吸管用生理盐水反复用力冲洗3 遍；②用组织剪剪去标本边缘部分，将猪皮放在已消毒好的木板上，用手术刀分离筋膜层，眼科剪清理残留的筋膜层；③用组织剪将处理干净的标本剪成0.3 ～0.5 cm 宽，3 ～4 cm 长的皮条，再将皮条从真皮-皮下脂肪层交界处剪开；④将脂肪层组织置于直径为5 cm 的平皿中，加入0.5%分离酶浸没，将平皿放入已消毒好的不锈钢饭盒中，4 ℃过夜；⑤次日再将平皿37 ℃热消化30 min，以生理盐水将组织漂洗2 次，用眼科镊将组织内残留毛囊下段挤出；⑥用组织剪将脂肪组织剪成米粒样大小，以0.2%Ⅳ型胶原酶于平皿中37 ℃消化4 h；⑦将尚未消化组织去除，向消化液中加入等量DMEM 后移入50 ml 离心管中离心，2 000 r/ min 离心10 min，倾去上清液，管底沉淀组织移入含DMEM 的平皿中清洗，将其中网络的大量猪毛乳头洗下，洗下液体再加入50 ml 离心管中离心，1 000 r/ min 离心5 min；⑧将清洗液移入10 ml 的离心管中500 r/ min 低速离心3 ～4 次，每次3 min，每次吸去上清液；⑨在10 ml 的离心管中以1 000 r/ min 离心5 min，去上清后加入含15%胎牛血清的完全培养基后接种。

1.2.2 猪毛乳头细胞的培养 将猪毛乳头每瓶80 ～100 个接种于50 ml 一次性培养瓶中，在37 ℃ 5%CO2饱和水气培养箱中培养。待大部分猪毛乳头贴壁后，更换培养基，细胞融合后可进行1∶3 传代培养。

2 结果

2.1 猪毛乳头细胞的分离

每次可获得超过 1 000 枚毛乳头，新分离的毛乳头呈椭圆形或圆形。

2.2 猪毛乳头细胞的培养

获得猪毛乳头后接种培养瓶做悬浮培养，接种后猪毛乳头细胞从猪毛乳头边缘中长出（图1a），逐步向四周呈放射状生长（图1b），此时猪毛乳头逐渐失去其原来的形状，形成成片的细胞生长致密区，最后散开的猪毛乳头细胞开始逐渐融合，融合后细胞大致仍由呈放射状排列的多个细胞团组成，中央区细胞出现多层化，并向上堆积形成凝集性生长（图1c）。

2.3 猪毛乳头细胞的传代培养

经胰酶消化并传代的毛乳头细胞，逐渐重新倾向凝集生长，随着时间的增加，凝集生长现象逐渐明显（图2a）。但随着猪毛乳头细胞传代次数增加，凝集性生长现象逐渐消失（图2b），6 代以后的猪毛乳头细胞基本不再出现凝集性生长现象（图2c）。

3 讨论

研究表明，位于毛囊基底部的特殊间质成分——毛乳头在毛囊的生长发育、周期调控及维持毛发生长中起主导作用。毛乳头的功能障碍是导致毛囊周期失衡和休止期脱发的主要起始因素[5]。因此研究毛囊的生长发育、调控机制应不能脱离毛乳头细胞的功能状态，对这方面的研究已逐渐成为毛囊生长、发育及周期调控的热点。目前对毛乳头细胞的研究已发现一些活性蛋白及细胞因子对毛囊的生长有调节作用，培养的毛乳头细胞最明显的特性是细胞融合前易于形成多层化的细胞团，即所谓凝集性生长的特性[2]。在前期的研究中，我们证实了毛乳头细胞在体外凝集性生长状态下的生物学功能明显强于非凝集性生长，有较强的诱导毛囊形成能力，而在非凝集性生长状态这种特性则减弱甚至消失[2-4]。因此，毛乳头的凝集性生长状态可能与其调控毛囊生长功能有着紧密联系。

图1 原代培养猪毛乳头细胞（4×10）

西藏小型猪来源于青藏高原、海拔2 500 ～4 300 m的农区和半农牧区，是惟一能够适应高海拔气候和以放牧为主的猪种，抗逆性好，封闭的地理环境使西藏小型猪保存了非常纯正的品种资源。我们在已建立和改进的二步酶消化法基础上，应用手术刀分离猪皮肤组织，1 h 内即可分离一直径5 cm 左右猪皮，相对于以往用眼科剪分离皮下筋膜层，大大减少了工作量，节省了分离时间。在用酶消化时，采用无菌不锈钢盒封装后才拿出超净台，可明显克服此步被污染的可能性；Ⅳ型胶原酶于平皿中37 ℃消化4 h，可分离到大量高纯度的毛乳头；本实验采用胶原酶对细胞的消化作用比较缓慢、温和，对毛乳头细胞的损伤和刺激不大，分离获得的毛乳头细胞体外培养生长迅速。

西藏小型猪毛乳头细胞低传代时细胞呈凝集性生长，6 代后呈非凝集性生长，这与人毛乳头细胞生物学相似[2]，其低传代培养上清可作为条件培养基进一步研究。西藏小型猪对人抗原性较弱，不易过敏，是目前研究毛囊较为理想的研究对象。

[1] Soma T, Fujiwara S, Shirakata Y, et al. Hair-inducing ability of human dermal papilla cells cultured under Wnt/β-catenin signalling activation [J]. Exp Dermatol, 2012, 21(4):307-309.

[2] 罗洋, 郝飞, 钟白玉, 等. 条件培养基对高传代人毛乳头细胞生长的影响 [J]. 中华皮肤科杂志, 2004, 37(11):648-650.

[3] 罗洋, 杜华, 王洁, 等. 人毛乳头细胞条件培养液治疗女性脱发的临床疗效观察 [J]. 西北国防医学杂志, 2011, 32(1):1-3.

[4] 罗洋, 郝飞, 杜华, 等. 人毛乳头细胞条件培养液治疗雄激素源性脱发的临床观察 [J]. 中国美容医学, 2009, 18(7):980-982.

[5] Kawano M, Han J, Kchouk ME, et al. Hair growth regulation by the extract of aromatic plant Erica multiflora [J]. J Nat Med, 2009, 63(3):335-339.