细胞蜡块结合免疫组化技术在胸腔积液中的诊断价值

陈 琛

(郑州大学第二附属医院病理科，河南 郑州 450014)

胸腔积液是一种临床常见的并发症之一，多见于恶性间皮瘤、肺癌以及间叶源性恶性肿瘤患者[1]，其中以原发肺腺癌患者居多，细胞形态学上分为小腺样、小乳头状、透线样及单细胞形态等。腺癌细胞的特征在上皮样间皮瘤中也可见到，两者鉴别很困难。目前，胸腔积液的病理诊断因缺乏间质细胞的增生，且不具备典型的组织形态结构，导致细胞学检查很多时候无法准确判定疾病的良恶性及其来源，易导致患者错过最佳治疗时机，从而增加了病死率[2]。细胞蜡块制备技术可以最大程度保留患者的标本，蜡块可以连续切片，结合免疫组化技术多种抗体联合运用，阳性颗粒定位在细胞质、细胞膜或细胞核，定位清晰，提高了胸腔积液的明确诊断率，还可以明确肿瘤组织来源。本研究旨在探讨细胞蜡块结合免疫组化技术在胸腔积液中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取郑州大学第二附属医院2018年7月至2020年5月79例送往病理科的临床高度怀疑恶性的胸腔积液标本，样本量200～500 mL。其中男31例、女48例，男女比例11.5；年28～83岁龄，中位年龄58岁；单侧胸腔积液68例，双侧胸腔积液11例；外观性状黄色62例，血性17例。

1.2 常规细胞学制片方法取50 mL胸腔积液标本置于50 mL试管中，以2 500 r/min的速度离心5 min，弃上清后用吸管吸取底部沉渣的上层白膜层，进行细胞涂片，立即固定在盛有体积分数95%乙醇的独立固定液瓶中，固定30 min后进行HE染色。常规细胞片固定后不用水洗立即进入苏木素染液5 min，流水冲洗返蓝，伊红染液染1 min，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，湿片封片。

1.3 细胞蜡块制作方法将临床送检的腔腔积液样本及时放在4 ℃冰箱中静置，10 h取出液体标本，将上清液轻轻倒去，留取底部沉淀的液体约50～150 mL，将漂浮在液体中的絮状物用竹签挑去，混匀后倒入50 mL离心管中，以2 500 r/min的速度离心5 min，富集细胞。用吸管沿着沉淀物的表面轻轻吸取白膜层，加入到已经备好的盛有质量分数4%的中性缓冲多聚甲醛离心管中，充分混匀后静止20 min，以2 500 r/min的速度离心5 min，，弃去上清，加入体积分数70%乙醇35 mL，振荡混匀，以2 500 r/min的速度离心5 min，弃去上清，而后加入体积分数95%乙醇，振荡混匀，以2 500 r/min的速度离心5 min，常温静置约2 h后用吸管轻轻吹打试管底部的沉淀物，将其吹打到与离心管底部分离开来，轻轻倒出已经凝集硬化的沉淀物，用滤纸包裹，放入取材盒内，盖上盒盖，放入德国Leica公司ASP300S脱水机中按程序处理后进行石蜡包埋，细胞蜡块制作完成。然后进行细胞蜡块切片，厚度4 μm，70 ℃烤片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇进水，HE染色，方法与常规细胞学制片一致。

1.4 免疫组化染色方法采用MaxVision检测试剂盒，每种抗体均设阳性对照和阴性对照。所选一抗为CEA、TTF-1、Calretinin、CK、CK7、CgA、Syn、CD56、D2-40、WT-1、P40、P63、CK5/6、NapsinA、CDX2、CA199、CA125、PAX-8、ER、PR。试剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司。细胞蜡块连续切片厚度为4 μm，黏附玻片捞片，70 ℃温箱内烤片2 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇过水后置于体积分数3%的H2O2中，室温10 min，以阻断内源性过氧化物酶。磷酸盐缓冲液冲洗。放入盛有已经沸腾的pH 9.0的乙二胺四乙酸二钠磷酸盐缓冲液的金属锅中，抗原修复20 min。自来水流水冲洗冷却，而后蒸馏水洗，磷酸盐缓冲液冲洗，将组织周围的水分用纸巾稍擦干后滴加一抗室温孵育1 h，磷酸盐缓冲水洗，二抗室温孵育30 min，磷酸盐缓冲水洗，二氨基联苯胺显色5 min，显微镜下控制显色的时间，用流水冲去二氨基联苯胺显色液，终止显色，苏木素复染30 s，梯度乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。染色结果判断参考文献[4]。

1.5 统计学处理采用SPSS 19.0处理相关数据，计数资料用百分数表示，比较用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 HE染色结果常规细胞学制片HE染色，因其中的间皮细胞及肿瘤细胞长期浸泡在胸腔积液会导致细胞发生形态学改变，如细胞结构模糊不清，细胞膜破裂、细胞核染色模糊等，涂片也会厚薄不均，从而增加临床诊断难度。细胞蜡块切片HE染色，细胞量大，细胞结构清晰，细胞核染色质均蓝色，细胞质粉染均匀，红蓝对比良好，染色鲜艳。

2.2 免疫组化染色结果不同病理类型原发肿瘤细胞免疫组化染色结果不同，腺癌主要表达TTF-1和NapsinA，鳞癌主要表达P40和CK5/6，小细胞癌主要表达CK、Syn、CD56和CgA，恶性间皮瘤及间皮瘤主要表达Calretinin、WT-1、CK5/6和D2-40。不同组织来源的原发腺癌免疫组化染色结果也不一样，肺腺癌组织主要表达CK7、NapsinA和TTF-1，胃肠道腺癌组织主要表达CK20、CEA和CDX-2，卵巢癌组织主要表达CA125、PAX-8、ER和PR，乳腺癌组织主要表达ER和PR。

2.3 细胞学制片和细胞蜡块结合免疫组化技术对恶性胸腔积液的明确诊断率比较细胞蜡块结合免疫组化技术明确诊断79例(100.00%)，而常规细胞学制片明确诊断39例(49.37.%)，细胞蜡块结合免疫组化技术明确诊断率明显高于常规细胞学制片，差异有统计学意义(χ2=53.559，P<0.001)。见表1。

表1 细胞学制片和细胞蜡块结合免疫组化技术对恶性胸腔积液的阳性检出率比较

3 讨论

临床上胸腔积液往往借助细胞学制片法进行检测，其具有操作简单、敏感性高等优点，但大量研究表明，单纯该方法的诊断准确率仅约为60%，难以满足目前临床上胸腔积液的诊断需求。随着病理技术的快速发展，沉渣包埋并结合免疫组化染色在胸腔积液诊断中得到更加广泛的应用[5]。细胞沉淀在聚集的过程中使其形态学结构与组织学非常相似，可以清晰展现出其来源组织的结构，如腺癌细胞的腺管样或乳头样排列，对于诊断有极大帮助[3]。同时，蜡块还可以永久保存，重复切片，并能有效进行免疫组织化学、分子检测、原位杂交等，同时还可以提取DNA、RNA对疾病进行深入研究。并且细胞蜡块在细胞学诊断、判断预后以及靶向药物治疗指导中的应用越来越重要。细胞蜡块HE染色结合免疫组化技术对胸腔积液中分化程度低、形态不典型的异型细胞也可以进行准确分型。在本次研究中，常规细胞学制片36例发现异型细胞，通过细胞蜡块结合免疫组化技术可以明确诊断为15例肺腺癌、4例胃肠道腺癌、2例卵巢癌、2例乳腺癌、1例恶性间皮瘤、12例良性间皮细胞增生。常规细胞学制片诊断的4例未分型恶性肿瘤，通过细胞蜡块结合免疫组化技术可以明确诊断为1例肺腺癌、1例卵巢癌、1例小细胞癌、1例恶性间皮瘤。因此，与常规细胞学制片相比，细胞蜡块结合免疫组化技术对判断肿瘤的类型以及临床寻找原发病灶、对症治疗有重要的指导作用。准确区分转移癌、间皮增生、间皮瘤等可有助于临床医师选择精准、有效的治疗方式[6]。研究[7]还发现，联合使用一组抗体可更有效鉴别浆膜腔积液中肿瘤细胞的来源及分类。本研究仅简单介绍了临床常用的免疫组化抗体来辅助诊断肿瘤类型和寻找转移肿瘤原发病灶，临床上还可以结合其他不同特异性抗体更好鉴别腺癌细胞和增生的间皮细胞，以进一步提高诊断的准确性[8]。

在处理血性胸腔积液标本时，应尽可能多离心以获取肿瘤细胞。其次，对红细胞的处理非常重要。红细胞过多，切片时标本会脱片，且肿瘤细胞被大量红细胞包裹会导致结构模糊、不易识别诊断，同时可能会严重影响免疫组化结果判读[9]；深红色血性胸腔积液的送检、取材、破红、细胞蜡块制作应及时，以免造成蛋白大量沉淀、红细胞包裹有核细胞、肿瘤细胞退变等[10]。一个优质的细胞蜡块应该能够保存细胞原有的成分、结构，尽量减少蛋白质、核酸等大分子的丢失，防止细胞器内的内质网、核糖体等物质被破坏，因此，固定剂的合理应用是保证优质细胞蜡块的关键。在本次研究中，体积分数95%乙醇能够去除蛋白质颗粒表面的水化膜，增加蛋白质黏度，造成细胞间的聚集，从而对部分大分子蛋白起到沉淀作用，质量分数4%中性缓冲多聚甲醛是最常用的组织细胞固定剂，在组织固定中甲醛的醛基与蛋白质的氨基结合形成羟甲基侧链，这是组织固定反应的基础，起到对细胞核酸与核蛋白、蛋白质与蛋白质之间框架稳固、保护细胞器普通结构的作用。体积分数95%乙醇去除蛋白质水化膜的原理，对浆膜腔积液沉淀物经甲醛固定15 min ，离心弃上清后再加入体积分数95%乙醇，经低速离心使其沉淀物能形成细胞凝块，这样保护了细胞蛋白质、核酸等成分。这种制备细胞蜡块的方法简便、快捷，组织脱水后第2天便能够与常规细胞学制片同步进行细胞学诊断，还不影响免疫组化、分子学检测等后续工作的开展[11]。

本研究结果还发现，细胞蜡块HE染色结合免疫组化技术明确诊断率显著高于常规细胞学制片，提示细胞蜡块结合免疫组化技术是目前临床上较理想的一种细胞病理诊断方法。另外，临床获取胸腔积液制作细胞蜡块基本属于无创性操作，获取标本更容易。

总之，细胞蜡块结合免疫组化技术可以极大提高胸腔积液的明确诊断率，并可以依靠免疫组化特异指标明确肿瘤组织来源，特别是对留取组织学标本困难的患者意义很大，是一种值得推广的微创诊断方法。