肿瘤睾丸抗原基因研究进展

朴军颜 综述，杨小昂 审校

(郑州大学河南省医药科学研究院，河南郑州450052)

当前，导致人类死亡的主要原因之一为恶性肿瘤。WHO统计结果显示，每年约有700万人因肿瘤而死亡［1］，而且这一数字呈逐年递增趋势。肿瘤发生是一个长期累积的过程，受多基因控制和多因素调节。诸如手术、化疗、放疗等传统治疗方法由于受适应证、禁忌证和毒副反应等因素的限制，治疗效果仍不理想。20世纪80年代以来，随着一系列鉴定肿瘤睾丸抗原(cancer-testis antigen，CTA)方法的逐渐建立，CTA的发现和鉴定成为可能，为肿瘤主动免疫治疗和靶向治疗的发展提供了新思路。

1 CTA的特征与CT基因的分类

与传统疗法相比，免疫治疗具有特异性高、杀伤能力强、全身毒副反应轻等优点。肿瘤抗原能够诱导机体产生特异性的免疫应答，因而获得特异性肿瘤抗原是开展免疫治疗的关键所在。目前在众多肿瘤相关抗原中，CTA 越来越引起研究者的关注与重视［2－4］。CTA具有以下特点:1)表达模式相同，即在除睾丸的正常组织中很少或几乎不表达;2)大多数CTA家族的基因位于X染色体上，并且存在多个家族成员;3)在不同肿瘤组织中，CTA表达常常具有异质性。现有资料显示:除睾丸外，一些正常组织也能表达CTA，例如SSX-2、NY-ESO-l、LAGE-1、RAGE-1 分别在甲状腺、乳腺、子宫、视网膜组织中有所表达，但CTA在这些组织中的表达程度远远低于其在睾丸组织中的表达程度，而且这种低表达的生物学意义尚不明确。

CTA是公认的在肿瘤抗原中免疫原性最强的一类，能够同时诱导机体产生细胞免疫应答和体液免疫应答。在恶性肿瘤特异性免疫治疗研究中，寻找表达CTA的基因已成为研究的最佳途径。在人体已知47个CT基因家族中，能够产生抗原反应并引起细胞或体液免疫的约有20个［5－6］。应用生物学技术方法分析检测可知，CT基因家族可分为3大类:1)具有T淋巴细胞识别特性的CT基因，如CT2、CT4和CT18等;2)抗体识别的 CT 基因，如 CT7、CT8、CT21、CT22、CT23、CT28、CT37、CT43 和 CT44 等;3)T 淋巴细胞和抗体共同识别的 CT 基因，如 CT1、CT5 和 CT6 等［7－8］。这些CT基因能够编码100个左右转录产物，大多数基因互不关联而且不存在遗传学进化链(CT1、CT3、CT7、CT10 及 CT4、CT12、CT16 有遗传相关性)。根据CT基因所处的染色体不同，CT基因或基因家族又可以分为以下2大类:1)X-CT基因或基因家族，是一类定位于X染色体上的CT基因，约30种，如NY-ESO-1、MAGE、SSX基因家族等;2)定位于不同的常染色体上的非X-CT基因，多为非家族性基因，如SCP-1基因定位于1号染色体上，而OY-TES-1基因则定位于12号染色体上。目前已知47个CT基因或基因家族的命名依据是发现的时间顺序［9］;通常在上述命名前还具有原标识符，以此尊重原发现者。

2 CT基因的表达

在不同肿瘤组织中CT基因的表达有很大差异，如在恶性黑色素瘤、肝癌、卵巢癌、前列腺癌组织中表达水平较高，而在结肠癌、肾癌等组织中表达水平较低;在同一类型的肿瘤组织中不同的CT基因表达水平也不尽相同，如MAGE-A1、NY-ESO-1和SSX-4的表达较高，而BAGE-A1和SCP-1的表达则相对较低;同一家族的不同CTA在肿瘤组织中的表达也不尽相同，如SSX家族中SSX-2和SSX-4在肿瘤组织中表达率较高，而SSX-1、SSX-3和SSX-5的表达率则较低;另外，CT基因的表达还呈现簇生趋势。

免疫治疗理想的条件是CT基因对肿瘤细胞的存活起关键作用并且其表达具有特异性及稳定性，而在肿瘤旁组织与正常组织中几乎不表达。目前许多研究者通过大量的实验证明DNA甲基化是CT基因调控的机制并且在CT基因的表达调控中起着重要作用［10-11］。Kim 等［12］的研究表明，DNA 低甲基化与核纤层结构相关，能够抑制CTA在肿瘤细胞中的表达，而且肿瘤细胞内的DNA甲基化与生殖细胞内特定的基因有关。

3 CTA的鉴定方法

鉴定CTA的方法主要有免疫学方法和基因表达分析法。20世纪90年代，研究者采用T淋巴细胞抗原决定簇克隆技术发现了CT1、CT2和CT4等基因，并证实这些基因仅存在于正常人体的睾丸和部分恶性肿瘤组织中;通过血清学表达克隆技术得到了与CT1存在的范围类似的CT5、CT6和CT8等基因。后来研究者通过mRNA表达分析技术发现了更多的CT基因，如运用代表差异性分析技术，发现了CT10和CT14;用差异显示技术和寡核苷酸序列分析技术，分别找到了CT11和CT25;利用生物信息学技术，分析表达序列标记数据库，得到了CT9、CT16、CT32和CT44等。然而，利用mRNA表达分析技术发现的某些CT基因并不能产生免疫反应。

3.1 T细胞表位克隆技术 Boon小组于1991年创立该鉴定方法并发现了MAGE-1/CT1.1、BAGE/CT2、GAGE1/CT4等［13］。目前利用此方法鉴定的肿瘤抗原主要为黑色素瘤抗原。然而由于采用这种方法需要建立自体靶细胞株而分离肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞，然而建立细胞株在许多肿瘤中困难较大并且敏感度低，因此这种方法不适用于鉴定常见的乳腺癌和结肠癌的肿瘤抗原。

3.2 多肽洗脱法 该方法是指结合生物化学手段洗脱可以引起肿瘤特异性T淋巴细胞应答的肿瘤抗原肽，这些肿瘤抗原肽可以在肿瘤细胞表面或主要组织相容性复合体分子上结合，质谱分析技术来确定肿瘤抗原肽的氨基酸组成，与肿瘤抗原肽相应的肿瘤抗原可以通过数据库检索确定［14］。这种方法尽管可获得CTA的天然多肽，但其对仪器及技术方面的要求过高，现阶段很难满足其发展的需要。高灵敏度质谱仪的问世和应用的普及可以为这一技术的发展注入新的活力。

3.3 cDNA表达文库的血清学筛选分析技术 是一种筛选肿瘤抗原的技术，其基于血清学分析和基因重组技术筛选临床肿瘤标志物，成为鉴定和发展肿瘤疫苗的重要措施。经其鉴定的CTA主要有SSX2/CT5.2、NY-ESO-1/CT6 和 SYCP-1/CT8 等［15］。

3.4 基因表达分析法 是一系列分析方法的综合，涵盖了差异显示技术、代表性差异分析技术、cDNA芯片分析技术、基因表达连续性分析技术、表达序列标签测序及大规模平行信号测序等。例如，Liang等［16］利用差异显示技术鉴定了CTp11/SPANX/CT11等;大量研究［17-19］采用代表性差异分析技术先后鉴定了LAGE-1/CT6.2、MAGE-E1/CT10和SAGE/CT14等。随后研究者通过cDNA芯片分析技术、基因表达连续性分析技术、表达序列标签测序技术及大规模平行信号测序技术陆续鉴定了MMA-1A/CT25.1、MAGEC2/CT7.2、PAGE-1、XAGE-1/CT12 和 CT45 等［20-24］。

3.5 生物信息学方法 是以SAGE及EST数据库为基础，通过该方法发现的新CT基因有BRDT、PAGE-4、PAGE-5、LDHCMAGE-B6、MAGE-C3、XAGE、CT15、CT17 等［25-31］。

4 CTA与免疫治疗

现阶段关于CTA研究尚处于基础阶段，甚至很多问题还不太清楚，但可以明确的是，CT基因及其编码产物CTA在细胞分化及增殖、细胞凋亡、信号传导、恶性肿瘤细胞耐药、基因转录、减数分裂、精子发育等方面起着重要作用［32-35］。Suri等［32］研究发现 SPAG9 是一种影响细胞增殖分裂以及肿瘤发生的CTA，在卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、肾癌与结肠癌组织中的阳性表达率分别是90%、88%、82%、88%和74%，而在这些肿瘤组织中能够产生体液免疫的概率依次为67%、80%、80%、77%、74%。由此可见，SPAG9具有很好的免疫治疗应用潜力，能够用来制备T淋巴细胞或B淋巴细胞表位多肽疫苗、树突状细胞疫苗以及单克隆抗体。Hudolin等［33］发现在睾丸淋巴瘤细胞中MAGEA1和NY-ESO-1LAGE-1共同存在时，两者各自的表达水平均比单独存在时要高得多，这将为多种CTA协同用于免疫治疗提供充分依据。de Carvalho等［34］的研究表明，多发性骨髓瘤细胞能够表达多种CTA，其中能够特异性表达的是MAGE-C1/CT7，其定位于X染色体上，对这种疾病的发生和诊断有重要作用，但将MAGE-C1/CT7用于多发性骨髓瘤的免疫治疗还需要进一步的体内外实验以及临床数据。另外，Rappu等［35］通过高灵敏度和高时间分辨率的荧光分析检测法，在黑色素瘤患者血清中检测出CT16基因的转录产物，这一研究发现为CTA用于免疫治疗开拓了新的途径。

对于肿瘤疫苗的制备有2个方面的要求:1)这种分子是能够在肿瘤组织中特异性表达的内源性物质;2)具有激发肿瘤免疫应答的特性，而CTA则同时具备上述条件而成为肿瘤疫苗研究的热点［36-37］。在肿瘤免疫治疗研究中，CTA的优势是能够选择性激发肿瘤患者体内的特异性细胞及体液免疫反应，而对正常机体没有作用。

用MAGE-3(1999年)和NY-ESO-1(2000年)制备的疫苗可以在患者体内引起免疫反应，但具体疗效仍难以评价［38-39］。目前中国药品食品监督管理局药审中心已通过了CT抗原NY-ESO-1b多肽疫苗的评定，NY-ESO-1b多肽疫苗能够诱导肝癌患者产生特异性的细胞免疫应答，进而有效遏制术后残留肿瘤细胞，有望成为一种有效的肿瘤辅助治疗手段。

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