紫外线抵抗相关基因在二烯丙基二硫诱导人白血病K562细胞自噬中的作用

王 萍，殷小成，彭艳辉，胡贤娇，杨云华

（南华大学附属第一医院儿科，湖南衡阳421001）

紫外线抵抗相关基因在二烯丙基二硫诱导人白血病K562细胞自噬中的作用

王 萍，殷小成，彭艳辉，胡贤娇，杨云华

（南华大学附属第一医院儿科，湖南衡阳421001）

目的观察紫外线抵抗相关基因（UVRAG）在二烯丙基二硫（DADS）诱导白血病K562细胞自噬中的作用。方法以K562细胞为细胞模型，利用透射电镜观察细胞的超微结构自噬体的形成；采用吖啶橙染色和荧光显微镜观察酸性囊泡的形成以检测DADS诱导K562细胞自噬；RT-PCR检测自噬相关基因UVRAG mRNA的表达水平。结果透射电镜显示：与空白组和溶媒组比较，DADS（40 mg·L-1）处理组可观察到胞质内出现大量自噬体。吖啶橙染色荧光显微镜下可见到各DADS处理组K562细胞胞浆中的酸性囊泡较空白组和溶媒组明显增多。RT-PCR结果显示，DADS作用K562细胞12h后，各DADS处理组UVRAG mRNA表达水平均高于空白组和溶媒组。结论DADS能诱导K562细胞自噬，其机制可能与上调UVRAG mRNA表达有关。

二烯丙基二硫；白血病；K562细胞；自噬；紫外线抵抗相关基因

自噬性细胞死亡又称为Ⅱ型程序性细胞死亡，与肿瘤的发生、发展及转移密切相关，已成为肿瘤研究领域的一个热点［1］。随着分子生物学的进步和对自噬的深入探索，自噬在白血病中扮演的角色日益清晰，将为白血病治疗提供一个新的靶点。二烯丙基二硫（diallyl disulfide，DADS）是大蒜中提取出的一种有机硫化物，是脂溶性物质，对乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌和白血病等的细胞均有抑制作用［2］。本课题组前期研究［3］发现DADS可以诱导人白血病K562细胞发生凋亡，且呈时间和剂量依赖性。然而关于DADS诱导肿瘤细胞发生自噬的研究鲜有报道。本实验从自噬角度探讨DADS能否诱导K562细胞发生自噬性死亡及其相关的分子机制，为DADS进一步研究及应用于临床提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂DADS购自美国Fluka公司，按说明书用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解配制，配置比例为1∶2，再加入质量分数0.9%氯化钠溶液进行稀释，稀释的倍数为100倍，DMSO终浓度＜0.01%；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI-1640培养基购自美国HyClone公司；Trizol购自美国GIBCOBRL公司；逆转录试剂盒购自加拿大Fermentas公司，PCR试剂盒购自广州东盛生物工程公司，PCR引物由美国Invitrogen公司合成；吖啶橙染色剂购自江苏碧云天生物技术公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组 K562细胞株购自北京协和细胞中心，细胞生长于含体积分数12%灭活新生胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中，置于37℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱内培养，每2 d换液1次。实验分为3个大组：空白组、溶媒组及DADS处理组。空白组不加DMSO，溶媒组加有同最高DADS浓度处理组等量体积的DMSO，DADS组分为10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、80 mg·L-1DADS 4个亚组，每个亚组重复实验3次。取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 透射电镜检测细胞自噬现象 收集空白组、溶媒组、DADS（40 mg·L-1）处理组作用12 h后的细胞，PBS洗涤细胞2次，800 r·min-1离心5 min，沿管壁逐滴加入质量分数3%戊二醛固定过夜，经环氧树脂包埋，制成半薄片进行定位，制成超薄片，醋酸铀及枸橼酸铅染色后，定位观察并拍照。观察到自噬小体为阳性，未观察到自噬小体为阴性。

1.2.3 吖啶橙单染荧光显微镜观察细胞自噬 取对数生长期K562细胞，用含体积分数12%灭活新生胎牛血清RPMI-1640培养基制成3.0×106mL-1的单细胞悬液，接种于无菌6孔培养板中，每孔2 mL。收集分别培养12 h后的空白组、溶媒组和各DADS（10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、80 mg·L-1）处理组细胞，离心去液体，每管加入0.1 mg·L-1吖啶橙1 mL重悬，避光，放置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中15 min，然后800 r·min-1离心5 min，去上清液，PBS洗涤2次，留取20 μL细胞悬液滴于载玻片上盖片封片后在荧光显微镜下观察形态学。如吖啶橙的绿色荧光转变成红色荧光说明细胞内酸性囊泡增多［4］。

1.2.4 RT-PCR检测UVRAG mRNA的表达 3 7℃、饱和湿度、体积分数5%CO2培养箱培养12 h后，收集细胞，PBS洗2次。依据TRIZOL试剂盒说明书提取总RNA，波长260/280 nm处测定其浓度和纯度；按照Fermentas逆转录试剂盒说明合成cDNA待用。紫外线抵抗相关基因（ultraviolet radiation resistance-associated gene，UVRAG的上游引物为5'-ATCTGTGTCTTGTTTCGTGGTG-3'，下游引物为5'-ATGAAGCCGTAGCAAAGAGAAG-3'，产物长度为277b p；内参GAPDH的上游引物为5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物为5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，产物长度为452 bp。扩增条件均为：94℃预变性2 min，变性温度94℃、45 s，退火温度53℃、50 s，延伸温度72℃、50 s，72℃、5 min，共35个循环，最后4℃保存。PCR产物各20 μL，在12 g·L-1琼脂糖凝胶中电泳分离，并在紫外灯下显影拍照。结果用AlphaImager 2200分析图像分析软件对PCR凝胶电泳图像进行灰度扫描，以目的基因与内参基因比值表示目的基因mRNA的相对表达量。

1.2.5 统计学处理 采用SPSS 13.0进行统计学分析，计量资料s表示，2组之间比较用t检验，多组之间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 透射电镜检测细胞自噬现象DADS（40 mg·L-1）作用于K562细胞12 h后，电镜下可观察到细胞胞质内有较多具有双层膜结构的自噬小体，呈圆形或新月形；内含未消化的胞浆成分或细胞器；空白组、溶媒组细胞形态结构规则，细胞核染色质均一，线粒体内嵴规则。提示DADS可诱导K562细胞发生自噬。见图1。

2.2 吖啶橙染色荧光显微镜观察细胞自噬现象自噬溶酶体的形成是自噬发生的重要标志之一，自噬溶酶体在细胞内是以酸性囊泡细胞器形式存在的。吖啶橙染色后发现，与空白组、溶媒组比较，不同浓度DADS（10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、80 mg·L-1）处理K562细胞12 h后，细胞胞浆中可呈现较多红色斑点状的酸性囊泡（即为自噬小体）。进一步证实DADS可诱导K562细胞发生自噬。见图2。

图1 K562细胞超微结构

图2 不同浓度DADS处理12 h后K562细胞中酸性囊泡的分布情况

2.3 RT-PCR检测UVRAG mRNA的表达情况不同浓度 DADS作用 K562细胞12 h后，空白组的UVRAG mRNA相对表达量为0.554±0.018，与溶媒组的0.572±0.018差异无统计学意义（P＞0.05）；UVRAG mRNA相对表达量随着DADS浓度增大明显增多，电泳条带变亮，10 mg·L-1组UVRAG mRNA相对表达量为0.621±0.025，20 mg·L-1组为0.671± 0.019，40 mg·L-1组为0.812±0.009，80 mg·L-1组为0.738±0.044，均高于空白组和溶媒组（P＜0.05），且不同浓度处理组之间两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 RT-PCR法检测UVRAG mRNA表达情况

3 讨论

自噬性细胞死亡作为非细胞凋亡死亡的一种主要方式在恶性肿瘤的发生、发展中起着十分重要的作用。自噬是指一些需降解的蛋白质和细胞器等胞浆成分被包裹，并最终运送至溶酶体形成自噬溶酶体降解的过程，生命体借此维持蛋白代谢平衡及细胞内环境的稳定［5］。目前，自噬已经成为继凋亡之后生物医学最热门的研究领域之一，自噬与肿瘤之间的关系成为了研究热点［6］。在对乳腺癌、前列腺癌、结肠癌使用抗肿瘤药物的研究中都出现了自噬性细胞死亡［7］。

自噬体和自噬溶酶体的形成是自噬性细胞死亡的重要形态学标志。透射电镜下细胞超微结构的形态学检测被认为是检测自噬体的金标准，也是首先发现并报道自噬的方法［8］。本实验采用透射电镜观察发现DADS（40 mg·L-1）处理组较空白组和溶媒组形成了大量自噬体，从而从形态学证实了DADS可诱导K562细胞发生自噬。吖啶橙是一种荧光色素，在细胞质和细胞核中呈绿色荧光，而在自噬酸性囊泡中呈红色荧光。故本研究利用吖啶橙染色，通过荧光显微镜观察不同浓度 DADS（10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、80 mg·L-1）作用K562细胞12 h后自噬的发生、发展变化，结果显示不同浓度DADS处理组较空白组、溶媒组细胞内红色荧光的酸性囊泡明显增加。进一步证实DADS可诱导K562细胞发生自噬。

UVRAG基因是Vps38的哺乳动物同源基因，作为肿瘤抑制基因被人所熟知，广泛参与乳腺癌、胃癌、结直肠癌等恶性肿瘤的发生、发展［9］。同时，UVRAG在细胞的自噬中发挥着关键性的作用。UVRAG可与Beclin 1相结合形成多蛋白复合物UVRAG-Beclin1-Ptdins3KC3参与自噬小体的形成［10］。为进一步探讨DADS诱导K562细胞自噬发生的分子机制，本研究采用RT-PCR技术在基因转录水平检测了UVRAG mRNA表达，结果显示：不同浓度DADS处理K562细胞12 h后UVRAG mRNA的相对表达量均高于空白组和溶媒组，提示DADS诱导K562细胞自噬的作用机制可能与UVRAG mRNA上调有关。

综上所述，DADS可诱导K562细胞发生自噬，其机制可能与UVRAG mRNA上调有关。越来越多的研究［11］表明自噬与凋亡存在着内在的联系，然而，在白血病的相关研究中，自噬和凋亡的关系却很少涉及。本课题组前期研究发现DADS对K562细胞有促凋亡作用，且呈时间和剂量依赖性发生凋亡，且最高凋亡率是在40 mg·L-1DADS处理K562细胞后出现，结合本实验结果，40 mg·L-1DADS处理K562细胞后自噬发生最明显，我们有理由相信DADS诱导K562细胞凋亡与自噬之间存在一定的关系，自噬的发生在对DADS诱导K562细胞凋亡时起着什么作用有待进一步研究。

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Value of Ultraviolet Radiation Resistance-associated Gene in the Diallyl Disulfide Induced Autophagy of Leukaemia K562 Cells

Wang Ping，Yin Xiaocheng，Peng Yanhui，Hu Xianjiao，Yang Yunhua
（Department of Pediatrics，the First Affiliated Hospital of Nanhua University，Hengyang 421001，China）

ObjectiveTo observe the value of ultraviolet radiation resistance-associated gene（UVRAG）in the diallyl disulfide（DADS）induced autophagy of K562 cells.MethodsK562 cells were chosen for this study.Their ultrastructure was observed by transmission election microscopy.The formation of autophagic vacuoles were observed by fluorescence microscope after acridine orange staining.RT-PCR was used to detect the expression levels of UVRAG mRNA.ResultsCompared with the blank group and the menstruum group，large amount of autophagosomes were observed in the cytoplasm of K562 cells treated with DADS（40 mg·L-1）；amount of autophagic vacuoles observed in all the DADS treatment groups were observed；the UVRAG mRNA expression levels were higher in all the DADS treatment groups after DADS treatment for 12 h（P＜0.05）.ConclusionDADS can induce autophagy of K562 cells，it may be related to the up-regulation of UVRAG mRNA expression.

diallyl disulfide；leukaemia；K562 cells；autophagy；ultraviolet radiation resistance-associated gene

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.02.001

R733.7；R730.23

A

1673-5412（2014）02-0093-04

2014-01-02）

国家自然科学基金资助项目（编号：31271482）

王萍（1988-），女，硕士在读，住院医师，主要从事小儿白血病基础研究。E-mail：wangping7048@sina.com

殷小成（1969-），男，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事小儿白血病基础与临床研究。E-mail：xcyin108@sina.com