大鼠骨髓间充质干细胞分离、培养及鉴定

王海峰，陈 文，刘艳艳，吴王泽

(1.菏泽医学专科学校，山东菏泽274000;2.武汉市中心医院检验科，湖北武汉430014)

大鼠骨髓间充质干细胞分离、培养及鉴定

王海峰1，陈 文1，刘艳艳1，吴王泽2

(1.菏泽医学专科学校，山东菏泽274000;2.武汉市中心医院检验科，湖北武汉430014)

目的 培养符合实验要求的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)并进行鉴定。方法 采用全骨髓贴壁法培养大鼠BMSCs，对细胞的形态及生长特性进行观察，并应用流式细胞术对细胞表面抗原CD29、CD34、CD45、CD90表型进行鉴定。结果 BMSCs呈贴壁生长，细胞状态良好，细胞形态以梭形为主，有时可见少量呈多角形，细胞平行排列生长或涡旋状生长;BMSCs高表达干细胞表面抗原CD29、CD90，而低表达造血干细胞表面抗原CD34、CD45。结论 全骨髓贴壁法培养BMSCs既简单又经济，通过多次传代可以达到细胞纯化的目的，对细胞的性状影响较小。

脊髓损伤;骨髓间充质干细胞;细胞表面抗原

脊髓损伤是一类严重的中枢神经系统的致残性疾病，由于神经系统的不可再生性，迄今为止，国内外已进行的脊髓损伤治疗均未取得满意的临床疗效。近年来，随着干细胞工程的推进，干细胞移植成为治疗脊髓损伤的研究热点。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)打破了神经干细胞的局限性，成为干细胞移植治疗脊髓损伤的新型“种子细胞”。本文旨在采用全骨髓贴壁法培养大鼠BMSCs，观察细胞的贴壁情况和生长特点，并采用流式细胞术对细胞进行检测，观察细胞表面抗原CD29、CD34、CD45、CD90的表达情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠，SPF级，鼠龄30 d左右，体质量250～300 g，由湖北省实验动物研究中心提供，合格证号:SCXK(鄂)2008-0005。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠BMSCs的分离与培养［1－3］取1月龄Wistar大鼠，断颈处死;严格无菌条件下取双侧后肢股骨和胫骨，去除骨表面的肌肉组织，Hanks液冲洗，剪去骨骺端，暴露骨髓腔;用5 mL的无菌注射器吸取Hanks液冲洗骨髓腔，收集冲出的骨髓细胞，反复吹打制成单细胞悬液;然后接种在T25的培养瓶内，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱内孵育。首次换液时间第3 d，以后每3 d换1次。待细胞融合达到时70%开始传代。

1.2.2 BMSCs表面抗原检测 体外分离培养的BMSCs经过质量分数0.25%Tryspin-EDTA消化，常规处理后Hanks液调整细胞浓度至1×1010·L－1;取100 μL样本分别加入以下抗体:CD29-PE/cy5、CD34-FITC、CD45-FITC、CD90-PE(冰上操作)。加入抗体的细胞冰上放置15～30 min，Hanks液洗1次，500 μL Hanks液重悬细胞;流式细胞仪检测。

1.2.3 BrdU标记细胞的免疫荧光 标记原理:5－溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)为胸腺嘧啶的衍生物，在细胞S期可替代胸腺嘧啶掺入到合成的DNA中。腹腔注射BrdU或细胞培养时加入BrdU，然后利用抗BrdU抗体，细胞免疫荧光染色显示BrdU可以作为一种细胞标记物［4］。BrdU作为一种嘧啶类似物，其标志方法简单，不存在放射性污染，而且BrdU标志的细胞只要不受到紫外线的照射，对细胞就没有功能损害［4－7］。当细胞处于DNA合成期而同时又有BrdU存在时，就会有BrdU掺入到新合成的DNA中，只要细胞不凋亡，这种BrdU就在细胞核的DNA中长期存留。细胞准备:将培养的细胞按适当的密度接种于6孔板内，6孔板的每个孔都有预先放入的无菌盖玻片。细胞贴壁生长4 d后分别在细胞移植前24、8 h加入BrdU，BrdU的终浓度为10 μmol·L－1。免疫荧光:将6孔板从培养箱拿出来弃去培养基，PBS洗3次，每次5 min;加入固定液(乙酸∶甲醇为1∶3)，立即吸干净倒掉，再加入适量的固定液，－20℃放置20～30 min;PBS洗3次，每次5 min。12 mol·L－1HCl溶液37℃变性1 h，吸掉HCl溶液，PBS洗3次，每次5 min。免疫反应:用自配的抗体封闭液封闭30～60 min，弃去封闭液，将一抗Antibody-BrdU(mouse fraction，1∶1 000稀释)加入6孔板内，37℃40～60 min或4℃过夜;PBS洗3次，每次5 min;二抗Anti-mouse IgG-FITC(1∶800稀释)加入，室温避光1～2 h;PBS洗3次，每次5 min;抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜下观察结果。

2 结果

图1 BMSCs培养的形态学观察(×100)

2.1 BMSCs的细胞形态观察 细胞接种24 h后，呈现贴壁性生长。72 h后更换新鲜培养基，细胞贴壁生长，大部分呈梭形，但有时可见呈三角形。培养2周左右贴壁细胞迅速增殖成簇生长或漩涡状生长，随着传代和细胞优势的自然选择可以得到纯化。见图1。

2.2 BMSCs的表面抗原鉴定 流式细胞仪检测显示:通过对不同代数的BMSCs的检测可以看出BMSCs高表达CD90、CD29，而低表达CD34、CD45。

BMSCs第1代的鉴定结果如下，流式细胞仪检测BMSCs表面抗原的表达率分别是:CD90 95.4%、CD29 97.2%、CD34 27.7%、CD45 27.7%。

BMSCs第2代的鉴定结果如下，流式细胞仪检测BMSCs表面抗原的表达率分别是:CD90 92.6%、CD29 98.5%、CD34 9.0%、CD45 9.0%。

BMSCs第4代的鉴定结果如下，流式细胞仪检测BMSCs表面抗原的表达率分别是:CD90 93.1%、CD29 96.3%、CD34 4.5%、CD45 4.5%。

BMSCs第9代的鉴定结果如下，流式细胞仪检测BMSCs表面抗原的表达率分别是:CD90 99.5%、CD29 100.0%、CD34 1.8%、CD45 4.6%。

2.3 细胞免疫荧光检测BrdU标记的BMSCs 移植前24 h在培养的BMSCs中加入BrdU，细胞免疫荧光检测目的细胞。荧光显微镜下观察:细胞核呈圆形或椭圆形，DAPI标志的细胞核呈蓝色;BrdU标志的细胞核呈绿色。DAPI标志的蓝色细胞核与BrdU标志的绿色细胞核的大部分融合在一起，证明BrdU可以作为BMSCs的标志物。见图2。

DAPI能快速进入细胞并能融入细胞DNA，因此DAPI可以用于标志活体细胞。在细胞增殖期，BrdU可以替代脱氧核苷酸而且可以随着DNA的传代而继续存在。因此，DAPI染色和BrdU染色可以显示细胞的位置。DAPI标志的细胞核显示蓝色，BrdU标志的细胞核显示绿色。

3 讨论

BMSCs具有高度的自我更新能力和多向分化潜能，是细胞治疗和基因治疗的理想靶细胞。骨髓中BMSCs的含量非常少，每10万个单核细胞中大约只有1个BMSC［8－9］，且随着年龄的增长细胞数量逐渐减少，如此微量的BMSCs难以满足治疗的需要。因此，寻找适宜的BMSCs体外分离、扩增、纯化的方法，对于进一步研究BMSCs的生物学特性尤为重要。目前常用的方法主要有4种:全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、细胞表面抗原标志分选法、细胞筛选法，其中以全骨髓贴壁法和密度梯度离心法最为常用。全骨髓贴壁法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化BMSCs的目的。随着对BMSCs表面抗原认识的深入，利用免疫方法如流式细胞术、免疫磁珠等方法对其进行分离纯化，但经过上述方法分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术难度高，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。而全骨髓贴壁法和密度梯度离心法虽然不如后2种方法获取的细胞纯度高，可是经过传代培养细胞仍然可以得到纯化，而且方法简单，细胞活性较高，成本低，步骤简单，细胞被污染的机会小，因此不管是从技术上还是经济上都是分离BMSCs的理想方法。

图2 BrdU标志BMSCs情况(×400)

BMSCs与造血干细胞、其他来源的间充质干细胞以及神经干细胞等一样，是干细胞中的多能干细胞，其不仅能自身复制，而且可以“横向分化”为各种组织细胞，Friedenstein等［10］首先发现了BMSCs的贴壁生长特性。本实验就是利用其贴壁生长特性来分离培养BMSCs，用培养基冲出大鼠骨髓后直接置于细胞培养瓶中培养，骨髓中的BMSCs会贴附于培养瓶底生长，然后更换培养基逐步除去漂浮生长的造血系细胞，这样BMSCs便可以逐步得到纯化。此时还有部分淋巴细胞、单核细胞与BMSCs一起贴壁生长。淋巴细胞、单核细胞贴壁较牢固，由于BMSCs在胰蛋白酶作用下容易脱离培养瓶底部，在传代时严格控制酶的量和消化时间，保证在短暂的作用时间内与培养瓶底分开，从而进一步纯化BMSCs［11］。本实验采取全骨髓贴壁培养法对大鼠BMSCs进行分离、培养和扩增，所培养细胞的形态多呈梭形、呈集落生长，与文献报道一致［12］。

大鼠骨髓取材的方法虽然很简单，但是一定要注意无菌操作，否则容易造成污染而影响细胞的培养。取材中一般要准备2套无菌器械，一套是用来分离股骨与胫骨，另一套则是用来在超净工作台中收集细胞。为了尽量避免凝血，本实验采用颈椎脱臼法处死大鼠，然后将大鼠在酒精中浸泡5 min。首先用一套器械去除皮肤和肌肉，再在超净工作台中用另一套器械打开骨髓腔冲出骨髓细胞，这样就可大大减少污染的机会，整个取材过程所用的时间越短越好。

BMSCs的表面抗原并不是独特的，其既有间质细胞的表面抗原特征，又具有内皮细胞、上皮细胞和肌肉细胞的表面抗原特征，因此到目前为止并未找到非常特异性的BMSCs标志分子。一般认为，CD29、CD44、CD166、CD105等是BMSCs的重要标志物［13］，而BMSCs不表达造血干细胞表面抗原，如造血前体细胞标志抗原CD34、成熟造血细胞标志抗原CD38、白细胞标志抗原CD45、淋巴细胞表面抗原CD11a和单核细胞/巨噬细胞表面抗原CD14。因为BMSCs目前还没有公认的独特抗原表型［14］，故本实验从细胞形态特点及CD29、CD34、CD45、CD90 4种表面标志抗原来鉴定BMSCs。本实验采用流式细胞术检测细胞的表面标记，实验结果证明培养的细胞高表达CD29、CD90而低表达CD34、CD45，说明本实验培养的细胞即非造血干细胞，也非成纤维细胞，而是不同于造血干细胞的另一大类的干细胞，即BMSCs，与文献［15］报道一致。

细胞移植首先遇到的问题是如何标志移植的细胞，进而跟踪其存活、生长、分化的过程，移植细胞的标志及对其在活体内的跟踪是此类研究中的关键环节。现在用于细胞标志的方法主要有同位素标志、荧光标志、超顺磁标志、BrdU标志及原位杂交检测等［16－22］。本实验采用BrdU标志，BrdU是一种嘧啶类似物，其尿嘧啶的碱基嘧啶环中与5位C原子连接的甲基被溴代替。当细胞处于DNA合成期而同时又有BrdU存在时，就会有BrdU掺入到新合成的DNA中，只要细胞不凋亡，这种BrdU在细胞核的DNA中会长期存留。与同位素和荧光标记技术相比较，BrdU抗体不与胸腺嘧啶发生交叉反应，没有放射性，经免疫组织化学染色即可观察BrdU在细胞内的掺入情况，避免了假阳性。适量的BrdU标记只要不受到紫外线的照射，一般不会产生大的毒副反应，对细胞生长、增殖、分化无明显影响［7，23］。BrdU对细胞毒性小，检测的特异性高、标志率高，而且实验过程迅速简便、安全，故其是反映细胞增殖及跟踪监测移植细胞动态变化的理想指标［24－26］。

4 结论

综上所述，得出结论:1)BMSCs的分离方法包括全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、细胞表面抗原标志分选法和细胞筛选法。由于后2种的方法费时费力，现在主要采用前两者;2)细胞表面标志CD29和CD90，表达率高达90%，而低表达造血干细胞的表面标志CD34和CD45，经过多次传代后BMSCs得以纯化;3) BrdU掺入到细胞DNA中作为细胞标记，对细胞损害作用较小，而且可以长期留在细胞内，有利于细胞移植以后检测移植细胞在脊髓内的情况。

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Isolation，Cultivation and Identification of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells of Rats

Wang Haifeng1，Chen Wen1，Liu Yanyan1，Wu Wangze2
(1.Heze Medical College，Heze 274000，China; 2.Department of Medical Laboratory，the Central Hospital of Wuhan，Wuhan 430014，China)

ObjectiveTo culture and identify the rat marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)fitting the requirement of experimentation.MethodsWhole bone marrow adherent culture method in vitro was used to culture the BMSCs of rats in vitro，the morphology and characteristics of the cells was observed，the phenotypes of CD29，CD34，CD45 and CD90 were identified by flow cytometry.ResultsBMSCs stuck wall growth in good condition，cells in a spindle primarily forms into fiber cell sample growth，sometimes visible small amounts of a polygonal cells，parallel arrangement growth or vortex shape growth.High expression of stem cell surface molecular(CD29 and CD90)and low expression of hematopoietic stem cell surface molecular(CD34 and CD45)were observed in the BMSCs.ConclusionWhole bone marrow adherent culture method is simple and economical BMSCs culture method，the purified cells can be achieved through the passage，and the method has the little effect on cell trait.

spinal cord injury;bone marrow mesenchymal stem cells;cell surface antigen

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.02.002

R329

A

1673－5412(2014)02－0097－05

王海峰(1987－)，女，硕士，主要从事肿瘤病因学的研究。E-mail:luckydogwang@163.com

2013－02－06)