中晚期鼻咽癌患者CD4+CD25+T调节细胞和Th17细胞的免疫病理意义

江志超，唐发清，田道法，范靖莹

（1.湖南省第二人民医院，湖南长沙410007；2.珠海市人民医院，

广东珠海519000；3.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南长沙410007）

中晚期鼻咽癌患者CD4+CD25+T调节细胞和Th17细胞的免疫病理意义

江志超1，唐发清2，田道法3，范靖莹3

（1.湖南省第二人民医院，湖南长沙410007；2.珠海市人民医院，

广东珠海519000；3.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南长沙410007）

目的探讨中晚期鼻咽癌患者外周血CD4+CD25+T调节细胞和Th17细胞的免疫病理意义。方法采用流式细胞术、RT-PCR方法检测15例中晚期鼻咽癌患者外周血CD4+CD25+T调节细胞、Th17细胞比例和Foxp3、ROR-γt转录活性，并与10例健康体检者相应指标进行比较，分析其免疫病理意义。结果中晚期鼻咽癌患者外周血CD4+CD25+T调节细胞比例及Foxp3转录活性明显高于健康体检者（P＜0.05）；而Th17细胞比例及ROR-γt转录活性低于健康体检者（P＜0.05）。结论CD4+CD25+T调节细胞、转录因子Foxp3和Th17细胞比例、转录因子ROR-γt共同构成一个平衡反馈体系，参与中晚期鼻咽癌患者肿瘤微环境中免疫耐受现象的发展及免疫逃逸的发生过程。

CD4+CD25+T调节细胞；Foxp3；Th17细胞；ROR-γt；鼻咽癌

肿瘤的发生、发展与机体的免疫细胞是否处于平衡状态密切相关，而作为细胞免疫的主体细胞T淋巴细胞及其亚群在肿瘤免疫中分化和作用不断地被认识。CD4+CD25+T调节细胞和Th17细胞是CD4+T细胞在不同的细胞因子刺激下所产生的亚群，CD4+CD25+T调节细胞作为对正向免疫应答起负向调控作用的T淋巴细胞亚群，在肝癌、肺癌、胃癌等多种实体瘤中数量增多，且与这些肿瘤的发生、发展密切相关［1］；而Th17细胞在肿瘤中的作用仍存在较大争议，可能同时具有促进肿瘤和抑制肿瘤的双重作用［2］。作者拟通过检测中晚期鼻咽癌患者外周血 CD4+CD25+T调节细胞、Th17细胞数量及其与相关转录因子Foxp3、ROR-γt水平，探讨CD4+CD25+T调节细胞和Th17细胞在中晚期鼻咽癌患者免疫耐受病理中的意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料收集湖南省第二人民医院、湖南中医药大学第一附属医院、湖南省肿瘤医院经病理检查确诊的中晚期鼻咽癌患者15例，年龄21～65岁，其中男11例，女4例；鳞癌9例，腺癌4例，未分化癌2例。所有患者均未接受过放、化疗等干预因素处理。并设立同期健康体检者对照组10例，年龄20～60岁。患者及健康体检者均签署了知情同意书。

1.2 试剂及仪器Human Regulatory TC ell Staining Kit、Human Th17 Flow TM Kit购于美国eBioscience公司，RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、UltraSYBR Mixture购自北京康为世纪生物科技有限公司，PCR引物由上海生工合成。Cytomics TM FC500型流式细胞仪为美国Beckman Coulter公司产品；荧光定量PCR仪为美国Thermo公司产品。

1.3 标本采集与处理符合纳入标准的15例中晚期鼻咽癌患者与10名健康体检者，分别于清晨空腹采集肝素钠抗凝的外周静脉血4 mL，用淋巴细胞分离液梯度离心法分离外周血单个核细胞，-70℃保存备用，用于流式细胞术分析和RT-PCR检测。

1.4 流式细胞仪检测外周血CD4+CD25+T调节细胞密度梯度离心法分离获得外周血单个核细胞。按Human Regulatory T Cell Staining Kit说明书进行操作，应用CD4、CD25、Foxp3抗体做细胞表面三色染色，采用FC500型流式细胞仪进行检测。测定10 000个细胞，激发波长为488 nm，发射波长为535 nm。分析时设门以除去细胞碎片和细胞团块，排除对测定过程的干扰。以同型抗体染色作为阴性对照。

1.5 流式细胞仪检测外周血Th17细胞将外周血单个核细胞在体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中调整细胞密度至2×106细胞/mL，加入50 μg·L-1佛波醇乙酯、离子霉素和莫能霉素共刺激培养5 h（37℃，体积分数5%CO2）；用三色标记的CD3、CD4、IL-17抗体对IL-17分子进行细胞因子胞内染色标记，按Human Th17 Flow TM Kit说明书进行操作。采用FC500型流式细胞仪进行检测，测定10 000个细胞，激发波长为488 nm，发射波长为535 nm，分析时设门以除去细胞碎片和细胞团块对测定的干扰。以同型抗体染色作为阴性对照。

1.6 RT-PCR检测Foxp3 mRNA和ROR-γt mRNA参照有关文献，运用Primer5.0软件设计引物序列，由上海生物工程技术有限公司合成ROR-γt引物。其中 Foxp3引物 Forward Primer为 5'-CACAACATGCGACCCCCTTTCACC-3'，Reverse Primer为5'-AGGTTGTGGCGGATGGCGTTCTTC-3'；ROR-γt引物Forward Primer为 5'-CCTGGGCTCCTCGCCTGACC-3'，Reverse Primer为5'-TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC-3'；β-actin引物 Forward Primer为 5'-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3'，Reverse Primer为5'-TAATGTCACGCACGATTTCC-3'。Trizol法提取外周血单个核细胞总RNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的浓度、纯度，显示提取的各样本总RNA具有很好的浓度和纯度后，继续后续的RT-PCR实验。用荧光定量PCR仪进行ROR-γt mRNA扩增，采用2-△△ct法计算Foxp3 mRNA相对表达量。

1.7 统计学处理采用SPSS 21.0处理数据，计量资料用s表示，数据符合正态分布，2组比较采用成组设计t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 CD4+CD25+T调节细胞和Th17细胞比例比较见表1，图1、2。

表1 CD4+CD25+T细胞、Th17细胞占CD4+T细胞比例比较%

2.2 Foxp3和ROR-γt mRNA水平比较中晚期鼻咽癌患者外周血 Foxp3 mRNA表达水平（3.699± 0.309）明显高于健康体检者（1.019±0.146），而ROR-γt mRNA表达水平（0.303±0.115）明显低于健康体检者（1.007±0.039），差异有均统计学意义（P均＜0.05）。见图3。

图1 健康体检者（A）和中晚期鼻咽癌患者（B）外周血CD4+CD25+T调节细胞流式细胞图

图2 健康体检者（A）和中晚期鼻咽癌患者（B）外周血Th17细胞流式细胞图

图3 Foxp3、ROR-γt基因表达水平比较结果

3 讨论

肿瘤的发生、发展涉及免疫监视、免疫耐受、免疫逃逸、免疫无能等与机体免疫紊乱有关的问题。免疫耐受现象的持续存在，可引起突变细胞对宿主体内免疫监视功能的无反应性，出现肿瘤细胞的免疫逃逸，其中起主导作用的细胞主要是CD4+CD25+T调节细胞［3-4］。诸多研究［5-6］表明，CD4+CD25+T调节细胞在肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌等恶性肿瘤患者外周血和病变组织中均有不同程度的升高，且与肿瘤的预后关系密切。本研究结果显示，中晚期鼻咽癌患者外周血单个核细胞中，CD4+CD25+T调节细胞占CD4+T淋巴细胞的比例明显高于健康体检者，提示中晚期鼻咽癌患者CD4+CD25+T调节细胞水平的升高，应该是该类患者病情进展的重要相关因素之一。同时，中晚期鼻咽癌患者外周血单个核细胞中Foxp3 mRNA表达水平也明显高于健康体检者，与CD4+CD25+T调节细胞数量比例变化趋势相一致，进一步显示了Foxp3 mRNA对CD4+CD25+T调节细胞分化与增殖活性的影响及其在肿瘤免疫耐受现象中重要作用。T淋巴细胞在不同的细胞因子的影响下，可以分化为不同的CD4+T淋巴细胞亚型，在TGF-β的影响下，可以分化为CD4+CD25+T调节细胞，而在同时有IL-6存在的情况下，则分化为Th17细胞。也就是说CD4+CD25+T细胞与Thl7细胞的诱导分化过程存在微妙的相互关系，影响着机体的免疫稳态，涉及肿瘤、自身免疫性疾病的发生［7］。

有关Th17细胞在肿瘤中的作用存在2种不同观点［8-10］：有研究认为Th17细胞能够促进肿瘤生长，也有研究认为这类细胞能够抑制肿瘤，甚至还有学者提出Th17细胞只是起着一个“旁观者”的作用。本研究发现，中晚期鼻咽癌患者外周血中，Th17细胞占CD4+T淋巴细胞的比例明显低于健康体检者，且ROR-γt mRNA表达水平也明显低于健康体检者。提示在中晚期鼻咽癌患者，Th17细胞及其转录因子ROR-γt应该具有积极的抗肿瘤作用。Horlock等［11］也发现，与健康体检者相比，乳腺癌患者外周血Th17细胞水平明显偏低，这同我们的观察结果是相一致的。

基于上述研究发现，中晚期鼻咽癌患者在CD4+CD25+T淋巴细胞数量及其转录水平升高的同时，伴随Th17细胞数量比例及其转录水平明显下降，表明这类患者体内存在CD4+CD25+T淋巴细胞与Th17细胞失平衡现象，有可能是促进中晚期鼻咽癌免疫耐受存在的重要原因之一。且这种不平衡可能还与病情进展过程有关，到了肿瘤的中晚期，Th17细胞减低趋势日益明显，而CD4+CD25+T淋巴细胞数量则更趋增多，免疫耐受现象更为突出。

［1］ Feng L，Wang X.Targeting Foxp3+regulatory T cells-related immunosuppression for cancer immunotherapy［J］.Clin Med J，2010，123（22）：3334-3342.

［2］ 李全林，顾方明，周俭.辅助性T细胞17与肿瘤免疫［J］.复旦学报：医学版，2010，37（4）：498-501.

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［11］Horlock C，Stott B，Dyson PJ，et al.The effects of trastuzumab on the CD4+CD25+FoxP3+and CD4+IL17A+T-cell axis in patients with breast cancer［J］.Br J Cancer，2009，100（7）：1061-1067.

Immunopathological Significance of CD4+CD25+Regulatory T Cells and Th17 Cells in Patients with Intermiddle and Advanced Stage Nasopharyngeal Carcinoma

Jiang Zhichao1，Tang Faqing2，Tian Daofa3，Fan Jingying3
（1.The Second People's Hospital of Hunan Province，Changsha 410007，China；
2.The People's Hospital of Zhuhai City，Zhuhai 519000，China；3.College of Integrated
Traditional Chinese and Western Medicine，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410007，China）

ObjectiveTo investigate the immunopathological significance of CD4+CD25+regulatory T cells and Th17 cells in peripheral blood of the patients with intermiddle and advanced stage nasopharyngeal carcinoma.Methods In this study，15 cases of intermiddle and advanced stage nasopharyngeal carcinoma of the observation group and 10 healthy persons of the control group were included to detect their ratio of CD4+CD25+T cells and Th17 cells in the peripheral blood by flow cytometry technique，transcriptional activity of Foxp3 and ROR-γt by RT-PCR procedure.Then，a comparative analysis was made to explore their implications in the immunopathological correlation of nasopharyngeal carcinoma.ResultsThe ratio of CD4+CD25+T cells to total CD4+T cells and transcriptional activity of Foxp3 in the peripheral blood among the patients with intermiddle and advanced stage nasopharyngeal carcinoma were significantly higher than those in the healthy persons（P＜0.05）.Meanwhile，the ratio of Th17 cells to total CD4+T cells and transcriptional activity of ROR-γt in the peripheral blood among the patients with intermiddle and advanced stage nasopharyngeal carcinoma was significantly lower than those in the healthy persons（P＜0.05）.ConclusionIt may be true that CD4+CD25+T cells，transcriptiona regulatory factor Foxp3，and Th17 cells as well as ROR-γt altogether compose of a regulating system in a balance feedback way to evolve the developing process ofimmune tolerance phenomena in the microtumor enviroment and the implication of immune escape among patients with intermiddle and advanced stage nasopharyngeal carcinoma.

CD4+CD25+regulatory T cells；Foxp3；Th17 cells，ROR-γt；nasopharyngeal carcinoma

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.02.004

R739.63；R730.23

A

1673-5412（2014）02-0105-04

2013-07-01）

国家自然科学基金资助项目（编号：30973856）；湖南省中医药管理局科研重点项目（编号：2010007）

江志超（1977-），男，博士，主治医师，主要从事头颈肿瘤防治研究。E-mail：jiang.zhichao@126.com

田道法（1951-），男，教授，主要从事头颈肿瘤防治研究。E-mail：tiandaofa@163.com