E 4031对慢性心衰大鼠离体心脏功能和心肌细胞内静息Ca2＋水平的影响*

白晓洁，郝峻涛，封启龙

（1.山西医科大学生理学系细胞生理学省部共建教育部重点实验室，太原030001；2.山西省人民医院胸外科，太原030012）

在慢性心力衰竭的病理发展过程中，心肌细胞内Ca2＋稳态破坏是关键的环节，不仅直接影响着心肌细胞的收缩舒张功能，而且会引发一系列Ca2＋依赖的信号通路异常，导致心肌细胞结构和功能改变。因此，纠正细胞内Ca2＋失衡是心衰治疗的策略之一［2，3］。E 4031是一种Ⅲ类抗心律失常药物，其机制主要被认为是选择性抑制Ik快速激活成分（Ikr），延长动作电位时程。近年来我们实验室发现除Ikr外，E 4031还可以激动心肌细胞膜钠钙交换体（sodium calcium exchanger，NCX），增强其内向和外向电流［1］。NCX是心肌细胞膜上的双向离子转运体，介导Na＋和Ca2＋的跨膜转运，对于心肌细胞内Na＋和Ca2＋稳态的维持具有重要的作用。E 4031具有激动NCX电流的作用，那么它是否会通过影响心肌细胞内Ca2＋水平而影响心脏功能？目前还未见相关报道。

本实验选用大鼠为实验动物（心肌细胞膜表面几乎不表达Ikr），通过缩窄腹主动脉建立慢性心衰模型，利用激光共聚焦显微镜系统和Langendorff离体心脏灌流观察E 4031对慢性心衰大鼠心肌细胞内静息Ca2＋水平和心功能的影响，并对其作用机制和临床意义进行初步探讨，旨在为临床心衰治疗靶点的选择提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备和实验分组

本实验采用成年雄性Wistar大鼠（150～200 g，山西医科大学实验动物中心提供），正常组不进行手术处理；模型组采用腹主动脉缩窄建立大鼠慢性心力衰竭模型：10%水合氯醛（0.3ml／100 g体重）腹腔注射麻醉，腹正中切口，于左肾动脉分叉处上方分离腹主动脉，将腹主动脉与7号注射器针头共同结扎（4-0号丝线），抽出针头，使该部位动脉形成狭窄。伪手术组不用丝线结扎腹主动脉，其余操作步骤同模型组。术后每只大鼠肌肉注射青霉素5×104U／d连续7 d。模型组动物分为对照组和E 4031组，对照组指直接对模型制备成功的动物进行指标检测，E 4031组指对模型组动物离体心脏和分离细胞进行药物干预后，再进行指标检测。

1.2 主要试剂和仪器

E 4031、Fluo-3／AM、HEPES购自美国 Sigma公司，其余为国产分析纯产品。

台氏液成分（mmol／L）：NaCl 140，KCl 5.4，NaH2PO40.33，HEPES 5.0，葡萄糖 10.0，MgCl21.0，CaCl21.8，用 NaOH调 pH值至 7.4。

Langendorff离体心脏灌流系统（AD Instruments）；RM6240多道生理信号采集处理系统（成都仪器厂）；蠕动泵（YZ1515，保定兰格恒流泵有限公司）；激光共聚焦显微镜（Olympus）。

1.3 实验方法

1.3.1 Langendorff离体心脏灌流检测心功能 采用Langendorff离体心脏灌流法，检测各组大鼠心功能及E 4031对模型组血流动力学指标的影响，具体操作步骤参见文献［4］。E 4031组动物在离体心脏台氏液灌流稳定后，转用含 E 4031（10μmol／L）的灌流液继续灌流5 min。分别在用E4031前后检测以下指标：左室发展压（LVDP）、左室收缩最大速率（＋dp／dtmax）、左室舒张最大速率（-dp／dtmax）等。

1.3.2 大鼠心室肌细胞急性分离 采用Langendorff离体心脏灌流装置，利用酶解法急性分离心衰大鼠心肌细胞，具体操作步骤参见已发表文献［5］。

1.3.3 激光共聚焦显微镜检测心肌细胞内钙荧光强度变化 将各组心肌细胞与钙荧光指示剂fluo3／AM共同孵育10～15 min后以台氏液冲洗残余染料。选取横纹清晰，杆状，表面干净平整，无自发收缩的细胞置于倒置共聚焦显微镜系统的载物台上进行连续动态扫描，细胞内荧光强度变化可指示细胞内游离Ca2＋离子浓度的变化。E 4031组指在模型大鼠心肌细胞平皿中加入 E 4031（10μmol／L），观察药物对细胞内游离Ca2＋离子浓度的影响［6］。

1.4 数据分析与处理

所有数据均以均数±标准差（¯x±s）表示，统计处理用SPSS 13.0软件进行分析，各组采用单因素方差（one-way ANOVA）分析，并用Newman-Keuls检验进行组间比较。

2 结果

2.1 各组大鼠离体心功能检测

与正常组和伪手术组相比，模型组离体心脏左室发展压（LVDP）、左室收缩／舒张最大速率（±dp／dtmax）明显降低（P＜0.05，表 1），表明模型制备成功。模型组动物给予 E 4031（10μmol／L）继续灌流后，血流动力学各项指标较对照组均有明显提高（P＜0.05，表 1，图 1）。

Tab.1 Hemodynamic indexesof rathearts（LV）in differentgroups（¯x±s，n＝10）

Fig.1 Effects of E 4031 to isolated heart function of rats with chronic heart failure（¯x±s，n＝5）LVDP：Left ventricular developed pressure； ±dP／dtmax：Maximal rise／fall velocity of left ventricular pressure*P＜0.05 vs control

2.2 各组大鼠心肌细胞内钙荧光强度检测

与正常组和伪手术组相比，模型对照组心室肌细胞静息钙荧光强度明显升高（P＜0.05，图2）。E 4031组心室肌细胞内静息钙荧光强度值首先呈现短期先升后降过程，然后在较低的水平保持稳定（P＜0.05，图 2）。

Fig.2 Effects of E 4031 on fluoresence intensity of intracellular free calcium in ratswith chronic heart failure

3 讨论

在长期的高压力负荷下，心肌细胞会依次经历代偿性肥大和失代偿性衰竭过程，最终导致心脏收缩力下降，组织器官灌注不足，严重者会影响到生命。在其病理生理机制研究中，心肌细胞内Ca2＋紊乱及其稳态的纠正一直是该领域研究的热点之一［2，3］。

E 4031是九十年代出现的一类Ⅲ型抗心律失常药物，研究表明，E 4031的抗心律失常作用与其抑制心肌细胞膜延迟整流钾电流（Ik），增加有效不应期（effective refractory period，ERP）时间，延长动作电位时程有关。除抗心律失常效应外，E 4031还具有增强心肌细胞收缩力的作用［7］，这种强心作用最早被认为是动作电位时程延长后，增加了平台期Ca2＋内流所致。2000年本实验室研究发现，E 4031对大鼠心室肌细胞NCX的正向和反向电流，均有明显的激活效应［1］。2002年本实验室又报道了尽管大鼠心肌细胞缺乏Ik通道，E 4031仍然具有增加Ca2＋瞬变和细胞收缩的作用，并证实这种效应与E 4031刺激反向NCX有关，在肥大心肌细胞效果更为明显［8］。

NCX表达和功能增强对于肥大或衰竭心肌细胞而言是利是弊存在争论，不同研究结论不同［9，10］。在我们的实验中，由于大鼠心肌细胞缺乏Ik通道，使得 E 4031的作用机制主要以激动 NCX为主。NCX转运方式具有双向性，取决于心肌细胞内外Na＋和Ca2＋的跨膜梯度及细胞膜电位，这种特性也成为其调节细胞内离子稳态的前提和基础，同时也决定了激动NCX对心肌细胞的收缩和舒张功能都有增强作用。实验结果也证实了这一点，与正常心肌细胞相比，压力负荷性心衰大鼠心功能降低，E 4031可以使衰竭心脏各项血流动力学指标LVDP、±dp／dtmax均显著增强。

心肌肥大／心衰时，心肌细胞 Ca2＋调节蛋白表达和功能发生改变，造成胞内Ca2＋稳态失衡。细胞膜两侧Na＋和Ca2＋跨膜梯度的改变为NCX转运提供了驱动动力，并决定其转运模式，最终的目的是趋向恢复细胞内外正常的离子平衡状态。在我们的实验中，E 4031与模型组大鼠心肌细胞共孵育后，首先引起细胞内Ca2＋短暂升高，然后很快下降，并保持在较低水平。这种结果可能与NCX的作用模式有关，心衰时细胞内Na＋浓度升高［9］，增加了反向NCX模式的驱动力，使得NCX功能增强后首先使细胞内静息Ca2＋水平上升，加重心肌细胞内Ca2＋超载。但是NCX也是心肌细胞内Ca2＋泵出的主要途径，细胞内Ca2＋浓度增高对正向NCX模式同样会有促进作用，进而引起细胞内Ca2＋浓度的下降。正是NCX的这种双向调节模式，最终使衰竭的心肌细胞内离子水平，特别是Na＋和Ca2＋水平趋于稳定，对衰竭心脏功能的维持具有一定的支持意义。Gotz Munch等人的研究结果也表明，心衰家兔短期（2周）在体钠钙交换体过表达，对心肌细胞的收缩功能有一定的损害，但是长期（6周）在体钠钙交换体过表达，却可以降低心肌细胞收缩和舒张功能的损害进程［9］。

根据实验结果，我们分析，E 4031对于衰竭离体大鼠心脏功能的增强作用，一方面可能与其增强心肌细胞钙瞬变的峰值和上升下降速率有关［8］，同时，E 4031对于衰竭心肌细胞内静息Ca2＋水平的维持以及各种Ca2＋依赖的下游活动的相对稳定，也可能是保持甚至恢复心肌细胞功能状态的原因，这些推论有待于深入的实验研究。

现有的很多研究认为，心衰发展过程中NCX的表达上调与心肌肥大／心衰的发生发展过程有关，抑制其活动可以有利于阻止或延缓疾病的进程。但是也有实验提示过度抑制NCX表达同样会导致心肌重塑，乃至心衰的发生［10］。这些结果表明，在病理刺激-心肌肥大-心衰的发生发展过程中，钠钙交换体的作用是值得我们进一步深入研究的，单纯抑制NCX，对心衰后心脏的功能而言，不一定是最佳选择。通过我们的实验研究发现，在衰竭的心肌细胞，NCX活性增强，最初确实会加剧细胞内Ca2＋超载，但是后期会使细胞内Ca2＋趋于稳定，并保持在相对正常的水平，同时心脏功能也有一定程度的恢复。所以，NCX在心衰发展过程中的作用和意义是有利有弊的，这也许是以 NCX为干预靶点研究的“瓶颈”，今后我们的研究方向可能需要围绕体内NCX调节网络及多靶点治疗，以恢复或纠正NCX的表达和功能为目标，而不是简单的抑制或激动。

［1］ WU DM，LU JY，WU BW.Class IIIanti-arrhythmia drug E-4031 potentiates Na＋／Ca2＋exchange current in rat ventricularmyocytes［J］.Acta Pharmacol Sin，2000，21（3）：249-252.

［2］ Vassalle M，Lin CI.Calcium overload and cardiac function［J］.JBiomed Sci，2004，11（5）：542-565.

［3］ 吴胜英，汪 雄，陈 艳，等.血管紧张素转换酶抑制剂和醛固酮受体阻断剂对钙超载大鼠心功能的影响［J］.中国应用生理学杂志，2007，23（3）：338-342.

［4］ 白晓洁，封启龙，刘 慧，等.NCXα1重复序列短肽主动免疫大鼠对心脏结构和功能的影响［J］.中国免疫学杂志，2009，25（4）：303-305.

［5］ 白晓洁，吴博威.抗钠钙交换体特异位点抗体对心肌钠钙交换电流的激活作用及其与钙通道、钠泵的交叉反应［J］.中国病理生理杂志，2008，24（6）：1078-1083.

［6］ 马会杰，董 梅，吉恩生，等.腺苷减少豚鼠心室肌细胞内游离钙浓度［J］.中国应用生理学杂志，2006，22（1）：58-62.

［7］ Wettwer E，Scholtysik G，Schaad A，et al.Effects of the new class IIIantiarrhythmic drug E-4031 onmyocardial contractility and electrophysiological parameters［J］.J Cardiovasc Pharmacol，1991，17（3）：480-487.

［8］ Cui X L，Zhao LY，Wu BW.E-4031 enhanced Ca2＋transient and ventricular myocytes contraction via reverse mode Na＋／Ca2＋exchange in normal and hypertrophic rats［J］.Acta Pharmacol Sin，2002，23（9）：797-802.

［9］ Münch G，Rosport K，Baumgartner C，et al.Functional alterations after cardiac sodium-calcium exchanger overexpression in heart failure［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，291（2）：H488-H495.

［10］Jordan MC，Henderson SA，Han T，etal.Myocardial function with reduced expression of the sodium-calcium exchanger［J］.JCard Fail，2010，16（9）：786-796.