海洛因诱导CPP大鼠伏隔核脑电活动的无线遥测研究*

朱再满，华田苗，周鸿铭，潘群皖，李 晶，李 敏

药物成瘾（drug addiction）是一种心理和身体依赖性的慢性复发性疾病［1］。目前认为药物成瘾的主要神经基础是脑内奖赏系统，中脑腹侧被盖区（VTA）、伏隔核（NAc）、前额叶皮质（PFC）、底外侧杏仁核（BLA）等构成的中脑边缘多巴胺系统，与药物成瘾密切相关［2］。Olds［3］提出的“VTA-NAc-PFC奖赏环路中，VTA及其投射区NAc是其主要的神经解剖结构，天然的奖赏性刺激都是通过作用于中脑边缘多巴胺系统，引起NAc内多巴胺（dopamine，DA）释放增多而产生奖赏效应。故NAc是产生奖赏效应的关键核团，在阿片类药物依赖形成机制中起着重要作用。

时间--频率分析显示，持续的新异刺激可导致人NAc脑电频谱发生变化，以θ波、β波变化最为显著［4］。麻醉和睡眠时相亦会影响大鼠NAc脑电活动频率的分布［5］。药物依赖个体NAc胞外脑电生理记录研究较少，且方法仅为动物麻醉状态的有线在体记录，海洛因依赖个体清醒活动状态NAc放电的无线遥测未见报道。本研究采用脑电无线遥测技术，结合条件性位置偏爱（conditioned place preference，CPP）系统，胞外记录海洛因诱导CPP大鼠NAc脑电活动对海洛因的电生理反应性，探讨其与大鼠位置偏爱及其觅药行为之间的联系。

1 材料与方法

1.1 材料

成年清洁级SD大鼠（南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，合格证号：scxk苏2007-0001）20只，体重290～320 g，雌雄不拘，常规饲养（室温24℃±2℃，12 h光照，配备充足的啮齿类饲料及饮用水）。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠NAc电极埋藏 1%戊巴比妥钠腹腔注射（ip，50mg／kg体重），行双侧 NAc电极埋藏手术，术中筛选颅骨前囟至人字缝距离大于9 mm的大鼠做电极埋藏。根据Paxinos大鼠脑立体定位图谱［6］，于颅骨表面（A：2.0mm，L：1.7mm，H：6.9mm）牙科钻钻孔，双侧置入镍铬丝电极。人字缝前两侧固定细螺杆，头皮下组织埋藏接地电极，自凝牙科水泥固封。术后恢复5 d，前3天连续肌注40万单位青霉素以防感染。实验结束后，大鼠麻醉、取脑，作快速冷冻组织切片，检查埋藏电极的位置，如位置偏离NAc则舍去所得数据。

1.2.2 海洛因诱导CPP大鼠模型制作、确认及海洛因戒断 大鼠埋藏电极后，设置海洛因诱导组和对照组各10只，分别编号。实验前将大鼠放入CPP系统黑白箱中自由习服，每天上午9∶00开始，持续45 min，连续3 d。习服结束后，做CPP测试，每只大鼠测试5次，每次15min，间隔1 h，观察大鼠在CPP系统中的运动情况，用JLBehv条件性位置偏爱视频分析系统（上海吉量软件科技有限公司）记录大鼠运动轨迹数据，统计每只大鼠黑、白箱中的停留时间、百分比及活动度。本实验中大鼠普遍偏爱黑箱，故选白箱为伴药箱，偏爱黑箱（在黑箱中平均停留时间超过540 s，即总时间900 s的60%以上）的大鼠进入下一阶段实验。

将海洛因诱导组大鼠赶至CPP系统白箱（伴药箱）中给予海洛因（安徽省公安厅提供）SC，第1天总量0.5 mg／kg，以后每天注射 2次（AM 9∶00，PM 3∶00），每次均递增 0.25 mg／kg。给药后，将大鼠置于伴药箱中45 min。自第2天开始，每天上午给药前，测定海洛因诱导组CPP相关数据，每次15 min。对照组注射等体积生理盐水，方法同海洛因诱导组。

大鼠连续注射药物5 d后，每日将测得的大鼠伴药箱停留时间与给药前数据个体自身对照分析，伴药箱停留时间超过给药前50%为位置偏爱建模成功。

1.2.3 大鼠戒断症状观察 造模结束并完成即刻状态NAc脑电记录后，停止注射海洛因和NS，使大鼠进入自然戒断状态，观察大鼠的戒断症状。连续4 d，应用柳田知司评分标准［7］，对大鼠的戒断症状进行评分。间断咬牙及轻度烦躁各0.5分，触碰激惹、间断性意向性震颤、轻度流涎各1分，异常姿势、靠近激惹、连续性意向性震颤、明显流涎各2分，流泪、软便各4分，腹泻、大便不成形8分，体重减轻2%～4%为5分、减轻4%～6%为10分、减轻6%～8%为15分。计算每只大鼠戒断症状的分值总和。

1.2.4 大鼠两侧NAc脑电活动的无线遥测 通过BW-200生理无线遥测系统（成都泰盟科技有限公司），记录各组大鼠两侧NAc的脑电活动。将微型无线遥测发射端子固定于大鼠背部，打开发射端子磁开关，输入电极分别连接地电极和左、右侧NAc埋藏电极，发射端子自动采集和发射NAc脑电活动活动，经智能接收机解码，经网络中心机输送至电脑，利用系统服务软件记录和处理脑电信号。给药前状态为造模前大鼠于白箱中记录，即刻状态为CPP建模成功大鼠给药10 min后白箱中记录，戒断状态取CPP大鼠戒断症状评分最高、戒断症状明显时记录。

1.3 数据统计

大鼠CPP数据通过CPP系统软件记录，并绘制大鼠运行轨迹图。NAc脑电活动遥测记录和快速傅里叶分析通过BW-200无线遥测系统软件完成，原始遥测脑电时间轴压缩20倍，间隔随机取样，自动生成各频率脑电百分比，脑电频率为δ波（0.5～4）Hz，θ波（4～8）Hz，α1波（8～11）Hz，α2波（11～13）Hz，β1波（13～18）Hz，β2波（18～30）Hz，分段统计各频率脑电百分比。所得数据用均值±标准差（¯x±s）表示，采用SPSS 11.5软件进行统计分析，不同状态下NAc脑电频率比例显著性检验用单因素方差（ANOVA）分析，并做方差齐性检验，两两比较用t检验。

2 结果

2.1 海洛因诱导大鼠白箱CPP的建立

习服后的大鼠分别做CPP测试，每只大鼠测试5次，每次15 min，记录大鼠黑白箱停留时间及百分比，描绘运行轨迹。已编号的海洛因诱导组大鼠和对照组分别与实验前比较，以白箱停留时间较给药前大于50%为标准。结果显示海洛因诱导组大鼠白箱给药5 d后，部分大鼠即可产生CPP，给药8 d后，大鼠白箱CPP显著；部分大鼠10 d以后才出现。轨迹图显示CPP大鼠白箱中活动时间明显延长，活动范围增大（图1），其中左箱为黑箱，右箱为白箱（伴药箱）。本研究所采用的海洛因剂量能使所有模型组大鼠都产生依赖性，且未发生过量中毒死亡情况。对照组大鼠未出现白箱CPP。

Fig.1 Trajectory of rats in the CPP system A：Before drug；B：Four days after drug；C：Eight days after drug

2.2 海洛因诱导CPP大鼠戒断症状评价分析

海洛因依赖建模之前，大鼠均未出现戒断症状。建模成功后突然停止注射海洛因和NS，模型组大鼠出现烦躁不安、异常姿势、意向性震颤、激惹、咬牙、流涎、流泪、腹泻等戒断症状；对照组未出现上述戒断症状。戒断第1～4天时，模型组大鼠戒断症状评分明显高于对照组（P＜0.01）。与建模前相比，模型组大鼠戒断症状评分显著增加（P＜0.01），其中戒断第2天时戒断症状最为显著（表1）。大鼠海洛因戒断症状评分比较的结果进一步证实了本实验动物模型的可靠性。**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs beforemodeling

Tab.1 Evaluating on heroin withdrawal symptoms of rats（¯x±s，n＝10）

2.3 海洛因诱导白箱CPP大鼠NAc脑电活动

2.3.1 大鼠NAc脑电活动脑电图描记 在白箱中分别记录海洛因诱导组大鼠NAc给药前、给药后即刻和药物戒断3个时期的自发脑电（图2），每个脑电图按时间轴压缩20倍截选10 s。记录的脑电图波形稳定，无干扰波，周期明显。脑电图显示，给药后即刻期脑电波（图2B）频率明显低于给药前期和戒断期，且脑电波时程较长，波幅较大。

Fig.2 EEG of the NAc in different stages A：EEG recorded before drug；B：EEG recorded immediately after drug；C：EEG in withdrawal stage

2.3.2 大鼠NAc脑电活动频率分析 记录的NAc脑电经快速傅立叶变换后，获取各频段脑电百分比（图3）。结果显示，各期δ波百分比最大，α2波百分比最小，各期不同频段脑电的分布梯度相同。大鼠即刻状态NAc脑电发放较给药前明显变化，δ波比例显著增大（P＜0.01），β1波、β2波比例显著减小（P＜0.01）；戒断状态与给药前比较，δ波比例增大（P＜0.05），α1波比例减小（P＜0.01），其余频段无显著差异；即刻状态较戒断状态δ波（P＜0.05）、α1波（P＜0.01）比例较大，β1波、β2波比例明显较低（P＜0.01）；即刻状态的δ波、β1波、β2波较其他状态皆有显著差异，其中δ波比例显著增大，β1波、β2波比例显著减小（P＜0.01），即刻状态 NAc脑电总体趋势是低频脑电比例较大，高频脑电比例较小。

Fig.3 Frequency spectrum of rat NAc EEG（¯x±s，n＝10）*P＜0.05，**P＜0.01 vs immediately after drug； ＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs before drug；△P＜0.01 vs before drug

2.3.3 大鼠NAc脑电波幅 对无线遥测系统记录的NAc自发脑电幅度进行统计发现，给药前自发脑电平均波幅最小，且和其余各组差异显著（P＜0.01），即刻状态平均波幅较高，且明显高于戒断状态（P＜0.01，图 4）。

Fig.4 Wave amplitude of rat NAc EEG**P＜0.01 vs before drug；＃＃P＜0.01 vs immediately after drug

3 讨论

脑内奖赏系统中，阿片类药物通过增强NAc中DA能神经元的功能活动，引起NAc内DA释放增加，亦可降低VTA中GABA能神经元活性，减弱其对NAc内DA能神经元的紧张性抑制，从而产生奖赏效应［8，9］。毁损伏隔核可减轻吗啡依赖大鼠的戒断症状和位置偏爱效应［10］，向伏隔核内注入阿片受体激动剂可使伏隔核内DA含量升高，并产生位置偏爱效应［11］，提示NAc是参与阿片类药物依赖形成的重要核团，但药物依赖不同时期内NAc神经元脑电活动的变化尚不清楚。

本实验采用脑电无线遥测技术，观察到大鼠在海洛因给药前、即刻状态、戒断状态的NAc脑电活动频率分布及波幅存在差异，提示海洛因对大鼠NAc脑电活动形态会产生影响。本实验采用的植入式无线遥测EEG记录技术，最大优势在于可以同步监测动物的EEG、活动度和行为学指标的变化，从而可以对EEG与行为进行同步研究，减少了动物受束缚的限制，可以使动物的应激状态最小化，能更好地反映动物的真实状态。植入式遥测EEG记录技术减少了动物在急性和慢性研究中受金属丝感染的机率，提高了EEG的质量，且持续记录的可控性强，可从几分钟至几个月，尤其适用于慢性动物实验［12］。

本研究利用CPP系统，成功建立海洛因诱导CPP大鼠模型，因位置偏爱箱为相对封闭状态，大鼠的行为数据皆可实时被记录和分析，模型可信度较高。大鼠位置偏爱出现时间从5 d到10 d，显示不同个体产生药物依赖的差异性。各状态脑电的频率分布均呈现相同梯度，其中δ波比例皆最大，α2波比例皆最小，表明了脑电信号的相对稳定性。有报道认为大鼠急性给予吗啡后，吗啡依赖组大鼠伏隔核放电平均频率降至2 Hz甚至2 Hz以下［13］，与本研究中大鼠给药后即刻期δ波比例较给药前显著升高（达45.58%）的结果一致，表明给药后有较多的NAc神经元出现同步化活动，与慢波睡眠期大鼠NAc的脑电活动特征相似［5］。戒断期的β2、β2波比例与给药后即刻期有显著差异，即低频脑电波比例减少，而高频脑电波比例又出现回升，并与给药前的无显著差异，提示海洛因戒断期大鼠伏隔核神经元活动的去同步化增强。因此，NAc神经元活动的同步化程度可能与海洛因依赖具相关性，这种同步化活动是否与NAc内DA或GABA递质系统的调节有关有待后续进一步研究。

治疗药物成瘾和依赖是当前医学界面临的一大难题。本研究发现，海洛因依赖伏隔核神经元放电形式、频率发生了改变，表明海洛因依赖对大鼠伏隔核神经元活动有影响。有形态学研究表明，电镜下海洛因依赖大鼠伏隔核神经元可见变性、凋亡，海洛因依赖可使伏隔核神经元超微结构发生变化［14］。海洛因依赖对脑内奖赏系统的相关递质的表达可能也有影响，尤其是VTA-NAc-PFC环路中相关递质的表达有待进一步研究。鉴于NAc在药物依赖中的重要作用，有研究用伏隔核毁损术毁损伏隔核的核心部以抑制大鼠海洛因自我给药的建立［15，16］，并有显著的效果。但因靶点毁损是不可逆的，伏隔核本身又与自然奖赏等人类本能行为密切相关，毁损后的心理学改变及长期影响亦需要研究。所以，我们拟借鉴电针对海洛因成瘾大鼠的行为干预［17］及脑深部电刺激（deep brain stimulation，DBS）在治疗癫痫［18］、帕金森症［19］等疾病中的应用，利用 NAc植入电极电刺激回输技术，探索治疗药物依赖的新途径。

［1］ Shalev U，Grimm JW，Shaham Y.Neurobiology of relapse to heroin and cocaine seeking：a review［J］.Pharmacol Rev，2002，54（1）：1-42.

［2］ Wang X，Zhou X，Liao Y，et al.Brain function of heroin addicts afterwithdrawal［J］.JCent South University（Medical Sciences），2011，36（8）：733-738.

［3］ Olds ME.Reinforcing effects ofmomhine in the nucleus accumbens［J］.Brain Res，1982，237（2）：429-440.

［4］ Zaehle T，Bauch EM，Hinrichs H，et al.Nucleus accumbens activity dissociates different forms of salience：evidence from human intracranial recordings［J］.J Neurosci，2013，33（20）：8764-8771.

［5］ HuntMJ，Matulewicz P，Gottesmann C，etal.State-dependent changes in high-frequency oscillations recorded in the rat nucleus accumbens［J］.Neurosci，2009，164（2）：380-386.

［6］ PaxionsG，Watson C.The ratbrain in stereotaxic coordinates［M］.sixth edition.Elsevier Academic Press，2005：62-72.

［7］ 高幸玲，莫志贤，邱轶汉.清风胶囊对吗啡依赖大鼠戒断后焦虑行为的影响［J］.中国药物依赖性杂志，2007，16：（6）430-434.

［8］ Koob GF.Drugs ofabuse：anatomy，pharmacology and function of reward pathways［J］.Trends Pharmacol Sci，1992，13（5）：177-184.

［9］ Zarrindast MR，Khalifeh S，Rezayof A，et al.Involvement of rat dopaminergic system of nucleus accumbens in nicotineinduced anxiogenic-like behaviors［J］.Brain Res，2012，1460（1）：25-32.

［10］EsmaeiliMH，SahraeiH，Ali-Beig H，etal.Transient inactivation of the nucleus accumbens reduces both the expression and acquisition ofmorphine-induced conditioned place preference in rats［J］.Pharmacol Biochem Behav，2012，102（2）：140-l56.

［11］Huda A，Meng F，Devine DF，et al.Molecular and neuroanatomical properties of the endogenous opioid system：implications for treatment of opiate addiction［J］.Seminars in Neuroscience，1997，9（3）：70-83.

［12］White AM，Williams PA，Ferraro DJ，etal.Efficientunsupervised algorithms for the detection of seizures in continuous EEG recordings from rats after brain injury［J］.J Neuros Methods，2006，152（1）：255-266.

［13］王 建，王庆丰，胡三觉.吗啡依赖大鼠伏隔核与海马腹侧下托放电频率的改变［J］.中国药物依赖性杂志，2006，15（4）：280-283.

［14］周 燕，叶 竣，韦献良，等.海洛因成瘾复吸大鼠中脑腹侧被盖区、伏隔核神经元超微结构和全脑多巴胺递质含量变化的研究［J］.广西医科大学学报，2005，22（2）：185-188.

［15］Hutchson DI，Parkinson JA，Robbins TW.The effects ofnucleus accumbens core and shell lesions on intravenous heroin self-administration and the acquisition of drug-seeking behaviour under a second-order schedule of heroin reinforcement［J］.Psychopharmacol，2001，153（4）：464-472.

［16］Alderson HL，Parkinson JA，Robbins TW.The effeets of excitotoxic lesions of the nucleus accumbens core or shell regions on intravenous heroin self－administration in rats［J］.Psychopharmacol，2001，153（4）：455-463.

［17］金 寰，潘贵书，陈远寿，等.电针对海洛因成瘾大鼠PAG的NPY表达的影响［J］.中国应用生理学杂志，2010，26（4）：485-488.

［18］Kahane P，Depaulis A.Deep brain stimulation in epilepsy：what is next［J］.Curr Opin Neurol，2010，23（2）：177-182.

［19］ McDonald LM，Page D，Wilkinson L，et al.Deep brain stimulation of the subthalamic nucleus improves sense ofwellbeing in Parkinson’s disease［J］.MovementDisorders，2012，27（3）：372-378.