长期运动对幼龄大鼠下丘脑脑源性神经营养因子表达的影响*

焦广发，高 峰，王海英，刘 徽，谢永涛，何玉秀△

（1.河北体育学院运动人体科学系，石家庄050041，2.河北师范大学体育学院，石家庄050041）

运动与摄食活动之间的关系复杂，一般认为中等强度的运动可刺激摄食活动，以补充运动中消耗的能量从而维持体重［1］。下丘脑是机体能量平衡和摄食调控的中枢，分泌的神经肽和神经因子参与运动对摄食活动的调节。脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）在神经元的生长、分化、成熟过程中发挥重要作用，近年来发现BDNF对摄食活动具有中枢性的调控作用，BDNF可引起体重下降和摄食减少，因此BDNF也是一种抑食欲因子。BDNF首先合成前体 BDNF（precursor of brain derived neurotrophic factor，pro-BDNF），经细胞外的水解酶剪切成为成熟的BDNF。研究表明，脑内BDNF和pro-BDNF受生长发育调节，在大鼠幼龄期变化较为显著［2］。短期的运动可使正常体重大鼠和肥胖大鼠海马内BDNF升高［3］。因此，下丘脑中的 BDNF可能在幼龄大鼠摄食活动中发挥重要的作用。目前，有关幼龄大鼠在发育过程中进行长期运动下丘脑内BDNF系统的变化和作用机制尚不清楚，为此进行本项工作。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

清洁级10周龄SD大鼠（河北省动物实验中心，许可证编号 SCXK冀2008-1-003），按前期方案制备孕鼠［6］，选取3周龄断乳雄性幼鼠进行实验。幼鼠用清洁自来水和国家标准大鼠饲料饲养（河北省动物实验中心提供），自由饮水摄食。饲料由河北省动物实验中心提供。实验室内湿度控制在50%±5%，温度控制在（23±2）℃，自然光照。幼鼠随机分为对照组（C）和运动组（E），每组各6只。C组安静不运动，E组每天运动一次。

1.2 运动方案

游泳运动方案采用无负重游泳运动，最初每次30 min，每周增加15min，运动量增加到60min后每周增加5min，第9周达到每次90 min。大鼠每天运动1次，每周运动6 d，共9周。

1.3 取材

大鼠取材前空腹8 h，停止运动48 h。腹腔注射0.5%的戊巴比妥钠（50mg／kg）麻醉，心脏取血，制备血清，-20℃保存备用。分离下丘脑，沿正中线分为两半放入液氮，-80℃保存。

1.4 血清BDNF测试

血清BDNF采用ELISA法，Wellscan MK2型酶标仪测试，美国Millipore试剂盒。

1.5 下丘脑组织BDNFmRNA测试

取右侧下丘脑组织提取总RNA，进行完整性分析和含量后，使用Fermentas公司反转录试剂盒（ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）进行反转录。反转录反应条件为42℃60 min，70℃ 5min。

引物由上海invitrgoen公司合成。按Takara公司RT-PCR试剂盒（SYBR Premix Ex Taq）配制PCR扩增反应体系，使用Applied Biosystems（ABI 7000）定量PCR仪扩增。扩增反应条件：95℃，10 s，1 Cycle；95℃，5 s，60℃，30 s，40 Cycle。目的基因和引物序列以及扩增产物量：BDNF上游引物：GTTCCACCAGGTGAGAAGGG，下 游 引 物：GCCTTCATGCAACCGAAGTAT，扩增产物量 75 bp；GAPDH上游引物 CAAGGTCATCCATGACAACTTTG， 下 游 引 物 GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG，扩增产物量496 bp。

1.6 下丘脑组织BDNF蛋白测试

取左侧下丘脑组织，液氮研磨，加入裂解液12 000 r／min 4℃离心 10 min。BCA法测定蛋白浓度。加入 5×loading buffer 100℃煮沸5 min变性。取30μg蛋白经12%SDS-PAGE凝胶电泳，转至NC膜上，室温下5%脱脂奶粉封闭30 min。分别用 BDNF和 pro-BDNF（4℃，兔多抗，1：100，美国 Santa Cruz公司），GAPDH（4℃，兔多抗，1：10 000）孵育过夜。TBST洗膜3min×5次。二抗室温孵育（羊抗兔-HRP，1：2 000）40 min。TBST洗膜TBST洗膜3 min×5次，加入ECL发光液，暗室曝光。UVP凝胶成像系统扫描胶片，以目的蛋白条带灰度值除以相应内参蛋白GAPDH条带灰度值得出最终结果。

1.7 数据统计处理

所有数据以均数±标准差（¯x±s）表示，统计处理用SPSS 11.5软件进行分析。Real-time PCR结果比较使用Wilcoxon非参数检验，其他指标不同组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 实验大鼠运动第1周、第9周摄食量、总摄食量以及体重变化

C组和E组大鼠在实验开始时体重无统计学差异，12周龄时E组大鼠体重低于C组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。两组大鼠在运动第1周和第9周每周摄食量无统计学差异，同时实验期间9周总摄食量也无统计学差异（表1）。

2.2 12周龄大鼠血清BDNF含量以及下丘脑组织BDNF mRNA和蛋白表达水平

E组和C组大鼠血清BDNF含量和下丘脑BDNFmRNA无统计学差异，但下丘脑组织pro-BDNF和BDNF蛋白表达水平E组和C组具有统计学差异，E组均高于C组（P＜0.05，表 2，图 1）。

3 讨论

本实验观察到幼龄大鼠在长期运动后体重较低，但在运动的开始阶段、运动的最后阶段以及整个运动期间大鼠的摄食量没有变化，说明本实验运动方案使幼龄大鼠维持了摄食活动的稳定。Broom等［4］报道跑台运动后食欲受到抑制，饥饿感不明显。尽管游泳运动可以改变食欲，但在人体的实验研究中并没有发现摄食量的真正增多。运动引起食欲减退现象一般出现在大强度运动后，儿童在急性的运动后摄食也会减少［5］。研究发现，小鼠进行转轮运动可以增加能量支出和食物摄入［6］。本研究结果提示幼龄大鼠长期运动仍维持正常的摄食活动，并不因运动出现摄食的增多或减少。

Tab.1 BW at3 week-old and 12 week-old and at the first and the ninth exercise week and total FIof rats（g，¯x±s，n＝6）

Tab.2 Serum BDNF，BDNFmRNA，BDNF and pro-BDNF protein in hypothalamus of rats（¯x±s，n＝6）

Fig.1 Expression level of pro-BDNF and BDNF protein in hypothalamus of rats by Western blot C：Control group；E：Exercise group；pro-BDNF：Precursor of brain derived neurotrophic factor；BDNF：Brain derived neurotrophic factor；GAPDH：Reference genes

近年来的研究揭示能量支出和食物摄入控制系统的复杂性，负责能量平衡的神经内分泌活动发挥关键作用。一次递增负荷运动后下丘脑弓状核中主要的神经递质变化与运动应激有关，而6周运动后神经递质的变化会产生适应［7］。这说明长期运动使下丘脑功能产生稳定性的变化。Rothman等［8］认为BDNF是能量代谢神经内分泌调节和行为活动之间的整合因子。本研究中幼龄期长期运动大鼠下丘脑BDNFmRNA表达水平没有变化，但pro-BDNF和成熟的BDNF蛋白表达水平均升高。

成熟的BDNF与pro-BDNF都具有生物学活性，但生物学活性作用存在差异，Pro-BDNF与成熟的BDNF功能和作用完全相反，并且BDNF的不足或不平衡导致精神及行为的改变［9］。因此，本研究中长期运动大鼠在实验期间内摄食活动没有变化与BDNF和pro-BDNF同时升高有关，推测长期运动引起BDNF升高的食抑制食欲作用与pro-BDNF升高产生的促食欲作用相互抵消。转轮运动可以引起大鼠脑内多个区域BDNF在转录水平上的表达，但BDNF的转录水平升高只发生在运动后几分钟到几小时内［10］。结合本研究中 BDNFmRNA的变化，说明长期运动更可能影响幼龄大鼠下丘脑内BDNF由mRNA向蛋白翻译的过程。

本研究中幼龄期长期运动大鼠血清BDNF没有发生显著变化。在中等强度运动后即刻血清BNDF可出现暂时的升高，在高强度的运动和力竭运动后的研究也发现，血清中BDNF出现一段时间的升高。但运动后血清中BDNF升高保持的时间较短，在运动停止后会迅速返回到基础水平，推测运动对安静状态下血清中BDNF含量影响较小。

综上，长期运动使幼龄大鼠下丘脑BDNF和pro-BDNF蛋白表达水平同时升高。