高脂饮食对慢性低氧大鼠肺组织eNOS／NO的影响*

赵艳霞，李玉红，王亚平，杨应忠，马 兰，格日力△

（1.青海大学医学院，西宁810001；2.青海大学附属医院，西宁810001）

由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化产生的一氧化氮（nitric oxide，NO）是一种细胞信号分子，可调节血管张力、维持血管稳态，对肺组织结构和功能有多重保护作用［1-3］。

肺组织NO含量被认为是高原低氧适应与习服的重要指标［4，5］。NO含量相应升高则低氧引起的肺动脉高压、肺水肿等肺部疾病发生率降低；NO含量降低，则易引起低氧相关肺部疾病。慢性低氧可引起机体氧化应激损伤，导致活性氧成分（reactive oxygen species，ROS）增加，ROS通过直接清除 NO和使eNOS脱偶联减少NO的产生而降低NO的生物利用度，导致肺血管舒张功能障碍及平滑肌细胞增殖，引起肺血管收缩及结构异常，进而引起肺部疾病［5-7］。已知除慢性低氧，高脂血症是影响肺组织NO含量又一重要因素［8，9］。高原低温低氧环境致使高原人群多有高脂饮食习惯，研究表明高原人群高脂血症发病率较平原增高［10］，然而，高脂血症对低氧环境人群肺组织的影响尚未见报道。

本研究通过分析高脂饮食对慢性低氧SD大鼠肺组织eNOS／NO的影响，探讨其可能机制，为进一步研究高脂饮食（或高脂血症）对低氧环境人群肺组织的影响提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 将体重180～200 g，6周龄清洁级雄性SD大鼠（由中国药科大学提供）24只随机分为3组（n＝8）：常氧（N）组（南京，海拔 10 m）、低氧（H）组（低压氧舱，模拟海拔5 000m）、低氧联合高脂饮食（H＋HFD）组（低压氧舱，模拟海拔5 000m），低氧联合高脂饮食组灌胃脂肪乳剂10 ml／（kg·d），每日一次，另外两组灌服等体积的生理盐水，普通饮食。于实验5周末取材，抽取大鼠外周静脉血于EDTAK2抗凝管，留取肺组织于-80℃冰箱保存。

1.1.2 脂肪乳剂 参考文献［11］方法制备脂肪乳剂：取猪油25 g放入200 ml烧杯内，在磁力搅拌器上加热至100℃，加入10 g胆固醇，溶化，再加入1 g丙基硫氧嘧啶，然后加入25 g吐温80，充分搅匀，制成油相。在另一200ml烧杯中加入30ml蒸馏水和20ml丙二醇，加热至60℃，然后加入2 g脱氧胆酸钠，充分搅拌至完全溶解，制成水相。然后将水相加入油相，充分混匀，即制成脂肪乳剂。

1.1.3 主要仪器和试剂 低压氧舱室（DYC-3000，贵州风雷航空机械有限公司，体积：8 m×3 m×3 m），BC-2300全自动血细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子有限公司），ABI7500荧光实时定量仪（美国ABI公司），分光光度计（北京元业伯乐科技发展有限公司），DU800核酸蛋白仪（德国BECKMAN），冷冻离心机（德国BECKMAN），高速组织匀浆机（德国Miccra D-8）。一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）检测试剂盒（南京建成生物公司），血脂检测试剂盒（北京利德曼生化股份有限公司），离心柱型-总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司），eNOS及β-actin一抗（美国Abcam公司），二抗（美国Santa Cruz Biotechnology lnc公司）。

1.2 方法

1.2.1 静脉血血红蛋白（Hb）浓度测定 使用 BC-2300全自动血细胞分析仪进行静脉全血Hb测定，严格按照仪器使用说明书进行操作，检测后采集数据。

1.2.2 血浆SOD活力和MDA含量测定 将抗凝血于3 000 r／min离心10 min，分离血浆，WST-1法测定 SOD活力，TBA比色法测定MDA含量。

1.2.3 血脂水平检测 采用终点法检测血浆总胆固醇（total cholesterol，TCH）及甘油三酯（triglyceride TG）含量，采用直接测定法检测血浆高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）和低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）含量。试剂盒由北京利德曼生化股份有限公司提供，严格按照仪器及试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 肺组织硝酸盐／亚硝酸盐（NOx）水平检测 采用硝酸还原酶法检测肺组织硝酸盐／亚硝酸盐（NOx）水平，间接反映肺组织NO含量。

1.2.5 肺组织eNOSmRNA水平检测 用离心柱法提取总RNA，按照TaKaRa FastQuant RT Kit说明逆转录合成cDNA，目的基 因 引 物 序 列：eNOS［12］上 游：5′-CTACCGGGACGAGGTACTGG-3′，下游：5′-GGAAAAGGCGGTGAGGACTT-3′，内参基因引物序列：β-actin［11］上游：5′-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3′，下游：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTT-3′。Real-time PCR反应体系（20μl体系）为：2×SYBR Select Master Mix 10μl，cDNA 2μl，上、下游引物各 0.4μl，灭菌双蒸水 7.2μl。试验在ABI7500荧光实时定量PCR仪中进行，每个样品设3个重复孔，目的基因与内参基因PCR反应条件一致，Holding stage：50℃ 2min，95℃ 2 min；Cycling stage：95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环，ABIPrism 7500软件采集和分析数据，采用2-△△Ct法进行计算。

1.2.6 肺组织eNOS蛋白水平检测 将肺组织切成小块，用蛋白裂解液裂解、匀浆、离心，取上清液用BCA蛋白分析试剂盒（Pierce Chemical Company，USA）测定样品的总蛋白浓度。5×蛋白上样缓冲液100℃变性5 min。采用12%SDS-PAGE分离蛋白，每泳道上样量80μg。电泳后使用半干转印槽（BioRad，USA）将蛋白转印至PVDF膜上。经5%脱脂奶粉室温下封闭2 h后，加入兔抗 eNOS（1：250），内参加入兔抗βactin（1：1 000），4℃下孵育过夜。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1：6 000），室温孵育2 h，随后使用ECL液进行发光显影，胶片扫描后，采用ImageJ软件对凝胶图像蛋白表达条带积分光密度值进行分析，计算目的（eNOS）条带与内参（β-actin）条带积分光密度值的相对比值。

1.3 统计学处理

结果用均值±标准差（¯x±s）表示，应用 SPSS 17.0软件进行统计分析，多组间采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 静脉血Hb浓度测定

结果显示 H组（244.50±14.17）g／L与 H＋HFD组（218.63±28.14）g／L大鼠静脉血 Hb浓度明显高于 N组（144.63±13.13）g／L，差异有统计学意义，说明低压氧舱模拟5 000m海拔建造慢性重度低氧大鼠模型成功，模型可用于实验研究。

2.2 血脂水平检测

血脂检测结果显示H＋HFD组TCH、LDL含量明显高于N组与H组；H组与H＋HFD组HDL含量明显低于N组；三组间的TG水平无明显差异（表1）。

Tab.1 Blood lipid changesof rats in two groups（mmol／L，¯x±s，n＝8）

2.3 血浆MDA，SOD水平的测定

MDA含量检测结果显示，H组（23.29±2.56）nmol／mgprot与 H＋HFD组（28.88±1.71）nmol／mg prot大鼠静脉血MDA含量明显高于 N组（20.64±2.33）nmol／mg prot，H＋HFD组MDA含量明显高于H组，差异有统计学意义。SOD活力检测结果显示，与 N组（183.91±10.20）U／ml比较，H组（172.13±8.38）U／ml与 H＋HFD组（156.10±8.16）U／ml SOD活力明显降低（P＜0.05）；与H组比较，H＋HFD组SOD活力明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 肺组织NOx水平测定

NOx含量检测结果显示，H组（3.75±1.12）μmol／g prot与 H＋HFD组（1.66±0.14）μmol／g prot大鼠 NOx含量明显低于 N组（8.20±1.57）μmol／g prot，（P＜0.05），H＋HFD组肺组织NOx含量明显低于 H组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 肺组织eNOSmRNA水平测定

荧光实时定量检测eNOSmRNA表达水平，采用2-△△Ct法进行计算，H组与H＋HFD组eNOSmRNA表达水平明显低于N组，而与H组比较，H＋HFD组eNOSmRNA表达水平明显降低（表 2）。

2.6 肺组织eNOS蛋白表达水平测定

eNOS蛋白表达水平检测结果显示，H组与H＋HFD组eNOS蛋白表达水平明显低于N组（P＜0.05），而与H组比较，H＋HFD组 eNOS蛋白表达水平明显降低（P＜0.05，表2）。

Tab.2 Expression of eNOSmRNA and protein in lung of rats（¯x±s，n＝5）

3 讨论

本研究通过检测肺组织eNOSmRNA与蛋白表达及NOx含量（间接反映NO含量），探讨高脂饮食对慢性低氧SD大鼠肺组织eNOS／NO的影响及其机制。结果显示，相对于常氧组与低氧组，低氧联合高脂饮食组肺组织eNOSmRNA及蛋白表达水平、NOx含量明显降低，血浆TCH及LDL水平、MDA含量明显升高；低氧联合高脂饮食组血浆SOD活力低于低氧组，表明高脂饮食进一步降低了低氧环境大鼠肺组织eNOS／NO水平，减弱其对肺组织的保护作用。

低氧组大鼠肺组织NOx含量明显低于常氧组，表明慢性重度低氧（低压氧舱模拟海拔5000m）降低肺组织NOx含量，该结果与以往研究一致［14］。低氧联合高脂饮食组肺组织NOx含量明显低于低氧组，联合因素使NO含量进一步降低，减弱其对肺血管的保护作用，引起肺血管收缩，肺动脉平滑肌细胞增殖，管壁增厚；同时影响血管内皮细胞功能，使其释放的缩血管物质增多，扩血管物质减少，进而加重了肺动脉收缩与重构，肺循环压力升高，引起肺血管的损伤［15，16］，提示对于慢性重度低氧性肺组织损伤的患者，高脂血症可能是其加重的独立危险因素，应予以预防和积极治疗。

慢性重度低氧降低肺组织NOx水平，其原因可能是慢性重度低氧情况下产生的活性氧成分（ROS）增多，即表现为膜脂质过氧化产物（MDA）增多，增加机体氧化压力；而抗氧化能力降低，即抗氧化指标SOD活力降低，引起机体氧化—抗氧化状态失衡。一方面，氧化—抗氧化状态失衡降低肺组织eNOS的mRNA及蛋白表达水平，减少eNOS催化底物产生的NO水平；另一方面，机体氧化压力增高，产生的活性氧可直接清除NO，降低 NO的生物利用度及水平［17，18］，损伤血管内皮，启动肺血管疾病的发生和进展［7］。本研究中，与低氧组相比，低氧联合高脂饮食组大鼠血浆MDA含量明显升高，SOD活力明显降低，加重氧化—抗氧化状态失衡；同时，低氧联合高脂饮食组大鼠血浆LDL及TCH明显高于低氧组，血脂异常不仅增加机体氧化压力及eNOS脱偶联［19］，还可通过诱导小窝蛋白，降低 eNOS与其从质膜上解离，从而降低eNOS酶活性，即联合高脂饮食因素使大鼠肺组织eNOS／NO水平进一步降低。

综上所述，本研究结果表明相对于单纯低氧，联合高脂饮食大鼠氧化应激损伤加重，抗氧化能力降低，肺组织eNOS／NO损伤加重，提示长期高脂饮食可能是慢性重度低氧引起肺组织损伤的独立危险因素，氧化—抗氧化状态失衡可能是其主要原因，应积极干预和治疗。在本研究中由于NO的半衰期短及实验条件限制，采用目前多数研究的方法，即通过测定NOx间接反映NO的含量，但NOx不能区分有生物活性的NO与被过氧化物清除的NO（硝酸盐与亚硝酸盐）；另外，本研究中如增设常氧高脂饮食组，更能揭示联合因素的影响，但考虑到实验室所在地西宁海拔高度为2 260 m，不能满足常氧条件，所以未设常氧高脂饮食组，我们会在以后的工作中尽量完善解决。

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