小鼠胰腺腺泡细胞钙振荡的激光共聚焦成像研究方法*

王静柯，赵梦琴，孙娜娜，孙芳芳，吴 杰，2，沈建新△，王海燕

胰腺腺泡细胞在体内受副交感神经末梢释放的乙酰胆碱（acetylchloline，ACh）调节，可分泌含酶胰液。体外研究发现ACh作用于胰腺腺泡细胞可产生钙振荡（calcium oscillations），表现为胞浆内钙信号的节律性升高和恢复。普遍认为，胰腺腺泡细胞钙振荡（pancreatic acinar cell calcium oscillations，PACCOs）与含酶胰液的分泌密切相关；而且，ACh作用于胰腺腺泡细胞并使后者产生钙振荡这一反应形式可成为研究相关胞内信号转导通路的实验模型［1-3］。

测定PACCOs的方法主要有二种：间接法和直接法。间接法：主要是利用全细胞膜片钳技术，记录在细胞外液中加入兴奋剂（如ACh）后胞浆Ca2＋浓度变化所激活的Cl-通道电流，通过Cl-通道电流间接反映 PACCOs的情况［4］。直接法：利用钙荧光指示剂与胞内Ca2＋结合后在相应波长的激发光作用下可发出特定波长的荧光的特点，通过荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜（laser scanning confocalmicroscope，LSCM）或双光子显微镜等仪器检测兴奋剂作用后引起的钙荧光变化，直接研究 PACCOs［1，3］。

本研究主要探讨建立一种简单易行而高效的PACCOs的LSCM成像研究方法，属直接法。选用的成年昆明小鼠，用胶原酶法急性分离得胰腺腺泡细胞，加荧光染料fluo-4-AM标记胞内钙；以乙酰胆碱（ACh）为兴奋剂作用于胰腺腺泡细胞，利用LSCM发射488 nm激光激发fluo-4和Ca2＋的复合物产生荧光并同步、实时、动态地记录此过程中的PACCOs，以建立一种可作为常规方法使用的小鼠PACCOs的LSCM成像研究方法。

1 材料与方法

1.1 胰腺腺泡细胞悬液制备

根据文献［4，5］并作适当改进，简要方法如下：取4～6个月（40～60 g）的昆明小鼠（由汕头大学医学院实验动物中心提供）称重，麻醉，颈椎脱臼处死；打开小鼠腹腔，取胰腺，用注射器向胰脏中注入胶原酶（日本 Wako公司）液（150～200 U／ml）0.5ml（以标准液配制）；使酶液充满其内部，再将整个胰脏放入盛胶原酶的离心管中，37℃水浴摇床消化10 min，取出用手振摇至有组织碎屑脱落；继续消化10 min后取出，摇匀；取胶原酶管中上层的细碎组织悬液至有2 ml细胞标准液的离心管中，用移液器吹打约100次，加标准液至 5 ml，1 000 r／min离心 1 min，弃上清；再加2ml标准液，重复以上操作3次，最后弃上清，加入适量标准液用移液器轻轻吹匀即得胰腺腺泡细胞悬液。标准液成分如下（g）：NaCl 8.18、KCl 0.34、CaCl20.11、MgCl20.131、HEPES 2.38、Glucose 1.80。

1.2 共聚焦成像观察与数据采集

取适量胰腺腺泡细胞悬液于标本槽中，待细胞贴壁后，加入钙荧光染料fluo-4-AM（终浓度20μmol／L）避光负载20 min，标准液灌流10 min即可开始用LSCM（型号为 Olympus FV-1000，配有 488 nm激光，20×和40×镜头）观察记录。扫描方式为连续二维扫描法（XYT）：单张图片分辨率为512×512，相邻两图片间时间间隔1.6 s，连续扫描200到400张图片，覆盖加药前、加药过程和加药后的全过程，同步、实时、动态地记录此过程中胰腺腺泡细胞在加入ACh后产生的钙振荡。实验在室温下进行，实验过程中保持胞外灌流标准液以维持细胞良好活性；ACh以标准液配制，通过靠近细胞的灌流小管施加（图1）。

1.3 数据的处理分析

综合应用Olympus Fluoview（共聚焦显微镜自带的软件）、ImageJ（美国NIH开发的免费图像软件）和Excel VBA编程的方法实现对图像数据的有效处理和统计分析。Olympus Fluoview可将原始图像数据转换为tif格式的系列图片，ImageJ可对tif格式的系列图片进行灵活的图像处理和灰度测量，Excel VBA编程则可将ImageJ测量所得的结果自动进行汇总、处理和统计分析。从钙振荡图像中我们提取的主要参数是平均钙释放量和钙振荡的频率。钙振荡频率以Hz表示，平均钙释放量则以△F／F0表示，其中，F0为静息情况下的钙荧光强度。实验设计以自身对照为主，统计处理用SPSS 13.0软件进行分析，多组间数据比较采用方差分析。

Fig.1 Diagram to show how to record adultmouse PACCOs using LSCM imagingA：The perfusion system；B：The LSCM imaging system；C：The computer；PACCOs：Pancreatic acinar cell calcium oscillations；LSCM：Laser scanning confocalmicroscope

2 结果

2.1 胰腺腺泡细胞钙振荡的共聚焦成像记录

急性分离的小鼠胰腺腺泡细胞在光镜下呈圆形、椭圆形或肾形，且经常两个或三个抱团存在，可分清分泌极（酶原颗粒集中处）和基底极；抱团存在时往往是分泌极相向靠近，而基底极朝外（图2A）。负载上钙荧光染料后，腺泡细胞在488 nm的激光激发下发出较均匀荧光（图2B）。将对应的光镜照片和荧光照片叠加则可观察胞内不同部位的钙荧光信号的分布情况（图2C）。通过灌流加药系统对胰腺腺泡细胞施以100 nmol／L的ACh，则可看到细胞内的钙荧光信号出现一定频率的明暗变化过程（图2D），这就是PACCOs。腺泡细胞钙荧光系列图片可用ImageJ进行荧光强度测量，之后经标准化处理，即可得到胞内钙荧光强度（△F／F0）-时间曲线（图2E，2G）。如在用标准液（SL）灌流时加入毒蕈碱型受体（M受体）阻断剂阿托品（atropine 1μmol／L），之后再加入ACh，则看不到胞内钙荧光强度的变化（图2F）。这说明，阿托品可完全阻断ACh激发的胞内钙振荡，而ACh则是通过M受体激发腺泡细胞产生胞内钙振荡的。这与文献中报道腺泡细胞膜上存在M3受体的事实是相一致的［6］。

Fig.2 PACCOs were induced by ACh steadily throughmuscarinic receptorsA：Visible light pancreatic acinar cells；a：The secretory pole；b：The basal pole；B：Fluorescent pancreatic acinar cellswith fluo-4 by confocalmicroscopewith 488 nm laser；C：Themerging image from A and B；D：A series of images to show Ca2＋ fluorescent change for PACCOs，the dashed circles show the areas tomeasure，and the numbers on the upper left corner（1～12）match with the numbers（1～12）in G；E：PACCOs were induced by ACh（100 nmol／L）steadily；F：PACCOs induced by ACh were blocked completely by Atr（1 μmol／L），amuscarinic receptor blocker；G：The enlargement ofmarked area in E，and the numbers（1～12）match with those in D；ACh：Acetylcholine；Atr：Atropine；SL：Standard solution；PACCOs：Pancreatic acinar cell calcium oscillations

2.2 胰腺腺泡细胞胞间和胞内不同部位钙振荡的特点

在连续二维扫描模式下，同一视野下的所有细胞的钙荧光信号变化都可被同时记录到。通过比较研究同一实验条件下不同细胞的钙振荡特点发现，同一视野下的不同细胞对于同一浓度的ACh（100 nmol／L）可有不同反应（图 3A）：有的细胞对 ACh比较敏感，加药不久后即可记录到典型的钙振荡，有的则要过长一点的时间才产生钙振荡；有的钙振荡幅度较大，有的则较小；有的频率较快，有的则较慢；有的钙振荡时程较短，有的则较长；还有的细胞根本对所施加的ACh没有任何反应。但对于抱团存在的细胞往往比较有规律可循：其中某一个细胞先产生钙振荡，然后邻近的细胞才出现钙振荡，有一定顺序，如此往复（图3B），比较同步。如果把图片分辨率增大，使同一视野下的细胞数减少而细胞的图像更清晰，这时我们可对胞内不同部位的钙荧光信号变化进行比较。结果发现：同一细胞内不同部位（如分泌极和基底极）的钙振荡幅度虽然不同（基底极的幅度要高于分泌极）但几乎同时产生且频率一致（图3C，3D）。

Fig.3 Features of Ca2＋oscillations among pancreatic acinar cells and among different zones inside one cellA：Ca2＋oscillations induced by ACh of different cells in one visual field；B：Ca2＋oscillations ofgrouped cells；1，2 and 3 in A and B：Cell numbers；C：Ca2＋ oscillations of different zones inside one cell；1 in C：The secretory pole，2 in C：The basal pole；a：Visible light image；b：The fluorescent image，Dashed circles：the areas tomeasure；c：The time course of Ca2＋oscillations and the numbersmatch with the numbers in the left image；D：The enlargement of marked area in C；ACh：Acetylcholine；SL：Standard solution

2.3 胰腺腺泡细胞钙振荡与ACh剂量的关系

为了可靠地探讨不同浓度的ACh对PACCOs的影响，我们采用了间隔两段式自身对照的实验设计。具体的实施过程如下：ACh分两段施加，第一段的给药浓度为 100 nmol／L，时间约 130 s；第二段（约 130 s）的给药浓度分别为 50 nmol／L，100 nmol／L和 200 nmol／L（图 4A），两段之间的时间间隔约 130 s。数据分析时选取第一段反应良好（△F／F0≥0.2，频率约0.05 Hz）的细胞，分别计算其第二段反应的幅度和频率与第一段反应的幅度和频率的比值（图4B，4C），从而分析ACh的剂量依赖效应。结果发现：一定浓度范围内（50 nmol／L～200 nmol／L），ACh的浓度越大，其激发的钙振荡幅度越大，钙振荡的频率也越高（图 4）。

3 讨论

Fig.4 Dose dependence of ACh for inducing PACCOsA：Representative time courses of Ca2＋oscillations induced by variable concentrations of ACh（50～200 nmol／L）；B：Ratios of Ca2＋oscillation amplitudes via 2nd segment VS 1st segment（the normalized Ca2＋release）；C：Ratios of Ca2＋ oscillation frequencies via 2nd segment VS 1st segment（the normalized Ca2＋ oscillation frequencies）**P＜0.01，*P＜0.05

用直接法研究PACCOs在不少文章中有提及，但不够具体，且多是作为其他方法的补充，印证其他方法的准确性，还较少作为一种常规方法使用。本文探讨了利用LSCM观察和记录ACh激发的PACCOs的方法，并对正常情况下PACCOs的特点进行较系统的研究。结果发现，LSCM下可直观而方便地记录到ACh激发的急性分离的小鼠PACCOs，且此反应可被毒蕈碱型受体（M受体）阻断剂阿托品完全阻断，说明此类钙振荡是通过M型受体相关的信号转导途径产生的，这与以前的相关研究相一致（图2）［6］。在此基础上，利用 LSCM可进行二维连续扫描的特点，观察比较了同一视野下不同细胞的钙振荡的特点，发现不同细胞的钙振荡在反应幅度和反应频率等方面各不相同（图3A），而抱团存在的细胞反应比较同步（图3B）；如提高图像的分辨率则可对同一细胞内的不同部位进行分区观察，发现同一细胞内的分泌极部位的钙振荡幅度比基底极部位的低，但频率完全一致（图3C，D）。这使我们对ACh激发的 PACCOs的认识更全面［2，3］。

本研究结果表明，对同一细胞先后两次施加同一浓度的ACh并不能得到完全一样的结果，而是第二次给药得到的效应往往弱于第一次。这可能与激光的照射和染料对细胞的生理功能有不利影响有关，也可能与相关受体的去敏感化有关，但目前尚未见有相关的定量研究和分析的文章。为了避开LSCM的这种可能弊病，本研究采用两段式的自身对照实验设计方法，可靠地研究了激发PACCOs的激动剂ACh的剂量依赖效应。这种两段式的实验设计有如下好处：（1）通过第一段的反应可对细胞进行初筛，去除反应异常的细胞；（2）以每个细胞第二段与第一段反应的比值反映钙振荡的特点，可系统地消除激光和染料的影响，而且使不同细胞间反应的比较更合理。采用类似的实验设计方法，我们也可方便而可靠地利用LSCM成像方法检测各种相关药物对PACCOs的影响，这对于本方法的推广应用有重要意义。

从本文结果可以看出，与间接法的全细胞膜片钳记录技术［4］相比，PACCOs的LSCM成像研究法有如下优点：（1）LSCM成像法的记录结果为图像数据，可做成动画再现钙信号变化过程，形象直观，而膜片钳法记录则做不到；（2）膜片钳一般只能钳制一个细胞，而在LSCM的连续扫描模式下，可同时观察记录视野下多个细胞的钙信号变化情况，效率较高；（3）LSCM法同时对多个细胞的记录还有利于比较研究不同细胞间的钙信号变化关系，这是膜片钳技术难以做到的；（4）另外LSCM法还可通过测量同一细胞不同部位的钙荧光强度以研究同一细胞内不同部位的钙信号变化关系，这也是膜片钳技术所做不到的。当然，膜片钳法有一个优点是LSCM法所不具备的：膜片钳可通过微电极实现胞内给药，研究胞内信号转导通路的各个环节，在机制研究方面有重要作用。不过，在条件具备时，LSCM法可与膜片钳法联用，二者取长补短，形成高效能的研究系统［7，8］。另外，膜片钳法的技术难度较高，需要较长时间的练习才能熟练掌握；LSCM法则相对简单易学，利于推广应用。

总之，通过本研究成功地建立了可作为常规方法使用的小鼠PACCOs的LSCM成像研究方法。结果证实：该方法稳定可靠，重复性好，且具有简单、易行、直观、高效（可实时记录同一视野内多个细胞的钙信号动态变化）、灵活（既可观察各个细胞的信号变化，也可观察胞内各部位间或不同细胞间信号变化的关系，还可与膜片钳记录法联用进行更深入、精细的研究）等特点，具有良好的应用前景和推广价值。

［1］ Orabi AI，Muili KA，Wang D，etal.Preparation of pancreatic acinar cells for the purpose of calcium imaging，cell injurymeasurements，and adenoviral infection［J］.JVisExp，2013，77：e50391.

［2］ Dupont G，Combettes L，Bird GS，et al.Calcium oscillations［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol，2011，3（3）：a004226.

［3］ Petersen OH，Tepikin AV.Polarized calcium signaling in exocrine gland cells［J］.Annu Rev Physiol，2008，70：273-299.

［4］ Wu J，Takeo T，Suga S，et al.2-aminoethoxydiphenyl borate inhibits agonist-induced Ca2＋signals by blocking inositol trisphosphate formation in acutely dissociatedmouse pancreatic acinar cells［J］.PflugersArch，2004，448（6）：592-595.

［5］ Park MK，Lee M，Petersen OH.Morphologicaland functional changes of dissociated single pancreatic acinar cells：testing the suitability of the single cell as amodel for exocytosis and calcium signaling［J］.Cell Calcium，2004，35（4）：367-79.

［6］ Nakamura K，Hamada K，Terauchi A，et al.Distinct roles ofM1 and M3 muscarinic acetylcholine receptors controlling oscillatory and non-oscillatory［Ca2＋］i increase［J］.Cell Calcium，2013，54（2）：111-119.

［7］ Petersen OH.Ca2＋signalling and Ca2＋-activated ion channels in exocrine acinar cells［J］.Cell Calcium，2005，38（3-4）：171-200.

［8］ Park MK，Tepikin AV，Petersen OH.What can we learn about cell signalling by combining optical imaging and patch clamp techniques［J］.Pflugers Arch，2002，444（3）：305-316.