克伦特罗单克隆抗体的纯化及其生物学特性的研究*

李晓丽，宁保安，刘 楠，马新华，欧国荣，高志贤

（军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室，天津300050）

克伦特罗（clenbuterol，CL）是一种β2-肾上腺素受体激动剂，可用于治疗呼吸系统疾病。当其使用剂量达到治疗剂量的5～10倍时，CL可增强肌肉发育，降低脂肪沉积。由于其特殊的生物学功能，常被非法用做饲料添加剂，导致其在畜产品中大量残留。人类食用含有克伦特罗的肉制品后会出现头晕、心悸、手指震颤等中毒症状。近几年，由于食用残留CL肉制品后引起的中毒事件屡屡发生。因此建立简便、快速、灵敏的克伦特罗的检测方法，对有效地预防食物中毒的发生是十分必要的。而免疫学检测是目前最快速、灵敏、高效的检测方法，为此，本文在对自制的 CL单克隆抗体［1］纯化的基础上，对其性质进行鉴定，旨在为今后对实际样品的检测及制备CL免疫检测试纸条和试剂盒提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 克伦特罗单克隆抗体（本实验室自制）；十二烷基磺酸钠（SDS）（Biotech，USA）；丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）（Gibco，USA）；过硫酸铵（AP）、2，2’-二甲基联苯胺（DAB）、沙丁氨醇、莱克多巴胺（Sigma，USA）；四甲基联苯胺（TMB）（Amresco，USA）；维生素 A、硫酸庆大霉素、山羊抗小鼠 IgG（HRP标记）、TMB（国产）

1.1.2 仪器 DYY-II型电泳仪（北京六一仪器厂）；凝胶成像系统（北京六一仪器厂）；MK3酶标仪（Thermo，USA）；SH-3双显恒温加热磁力搅拌器（北京金北德工贸公司）；5ml免疫亲和层析蛋白纯化柱（天津华生生物有限公司）；半干转移仪（大连竞迈生物科技有限公司）

1.2 方法

常规 ELISA法操作步骤［2］：（1）用包被液（pH 9.6的碳酸盐缓冲液）溶解包被抗原，37℃孵育2 h（或4℃过夜），PBST洗涤三次。（2）加含 3%OVA的PBS溶液封闭，37℃孵育 1 h，洗涤。（3）加 CL-BSA免疫小鼠血清（或杂交瘤细胞上清液、腹水）及阴性对照样，37℃孵育1 h，洗涤。（4）加最适稀释度的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育0.5 h，洗涤。（5）加TMB底物使用液，室温避光显色15 min。（6）加终止液，50μl／well。用酶标仪测 A450值。1.2.1 ELISA测定单克隆抗体活性［3］以 CL-BSA偶联物作包被抗原，加系列稀释的杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水为一抗，骨髓瘤上清孔为阴性对照，常规ELISA方法操作。用酶标仪测A450值。确定A450值大于阴性对照A450值的2.1倍的抗体反应为阳性，其所对应的抗体稀释倍数即抗体效价，抗体效价高低说明抗体活性的高低。

1.2.2 ELISA测定单克隆抗体亲和常数［4，5］用三种稀释度（1∶50、1∶100、1∶200）的 CL-BSA作包被抗原，以系列稀释的杂交瘤细胞上清液为一抗，按常规ELISA法操作。加终止液后450 nm处测A值。以单克隆抗体的不同浓度为横坐标，以其相应的A450值为纵坐标，绘制出3条测定曲线，以各线上部趋于平坦的 A450值为100%，查出 A450值为50%的浓度［Ab］t，这样可以得到［Ab］t、［Ab′］t、［Ab″］t 3个值。按下列公式计算 K值：K1＝1／2（2［Ab′］t-［Ab］t）；K2＝1／2（2［Ab″］t-［Ab′］t）；K3＝3／2（2［Ab″］t-［Ab］t）。所得3个K值，取平均数即为亲和常数。

1.2.3 抗体特异性的测定［6］（1）ELISA测定单克隆抗体与BSA的交叉反应：用BSA作包被抗原，同时包被CL-BSA。加系列稀释的杂交瘤细胞上清液为一抗，骨髓瘤细胞上清为阴性对照，按常规ELISA法操作。用酶标仪测A450值。（2）与几种结构类似物的交叉反应：选择与克伦特罗结构和功能类似的四种药物：莱克多巴胺、沙丁胺醇、硫酸庆大霉素、维生素A。将各药物均配制成系列浓度，采用间接竞争ELISA法进行测定，各药物系列浓度水平设2个复孔，取平均值。以各药物浓度为横坐标，B／B0%为纵坐标，作出各药物的抑制曲线。由间接竞争ELISA方法测得A值及抑制曲线，找出IC50值范围，并计算各自的交叉反应率。交叉反应率（%）＝IC50药物 ／IC50试验药物 ×100［7］。

1.2.4 腹水型单克隆抗体的纯化 （1）盐析（硫酸铵沉淀法）［8］：用常规硫酸铵沉淀法纯化腹水中抗体，收集每步沉淀和上清进行间接竞争ELISA试验，验证每步盐析的上清和沉淀中的抗体活性，分析结果可得知每步盐析所得成分中克伦特罗单克隆抗体活性。（2）免疫亲和柱层析纯化抗体［9］：将含有活性抗体的盐析分离成分进一步用免疫亲和层析柱纯化，以得到纯度更高的抗体。将每步纯化所得成分做SDS-PAGE实验和ELISA实验，以确定纯化效果及抗体活性。

1.3 检测克伦特罗标准曲线的建立［10，11］

将 CL标准品倍比稀释（0.01～100 ng／ml），以CL单克隆抗体为一抗，采用间接竞争ELISA方法建立标准曲线，以无CL抑制时的A450值为B0，相应浓度CL抑制时的A450值为B，即以 B／B0为纵坐标，以CL浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线，建立曲线方程。

2 结果

2.1 单克隆抗体活性测定结果

经ELISA法测定，得知杂交瘤细胞上清液和小鼠腹水中CL单克隆抗体的效价为106，说明本实验制备的CL单克隆抗体活性较高。

2.2 单克隆抗体亲和常数测定结果

经ELISA测定，1A2杂交瘤细胞株培养液上清与三个稀释度的 CL-BSA包被原（1∶50，1∶100，1∶200）的反应曲线如图1，以各曲线上部趋于平坦段的A值为100%，查出其A值为50%时对应的单克隆抗体浓度［Ab］t，根据亲和常数计算公式得到单克隆抗体亲和常数为：K＝2.90×1010mol／L（图 1）。

2.3 抗体特异性

2.3.1 与BSA的交叉反应 用ELISA法检测单抗对BSA的交叉反应，结果显示抗体对BSA反应为阴性，随抗体浓度增加A450值无变化；而对CL-BSA反应为阳性，并且随抗体浓度的增大A450值也呈梯度增大。表明本实验制备的单克隆抗体与BSA无特异性结合反应，只与CL发生特异性结合，从而证明单克隆抗体是完全针对CL小分子的（图2）。

Fig.1 Antibody affinity analytic curve of the hybridoma cell culture fluid supernatant

Fig.2 Reaction of the monoclonal antibody to BSA and CL-BSA

2.3.2 抗体与几种克伦特罗的结构及功能类似物的交叉反应（表1）

Tab.1 Cross-reaction rate of clenbuterol antibody with other analogs

2.4 腹水盐析后抗体活性（效价）测定结果

腹水盐析后抗体活性（效价）测定结果表明：50%的硫酸铵盐析后所得沉淀中活性抗体效价最高，达106。因此可将50%的硫酸铵盐析后所得沉淀进行下一步的纯化，以得到高纯度的抗CL单克隆抗体（图 3）。

2.5 免疫亲和层析柱纯化抗体结果

2.5.1 SDS-PAGE结果 纯化后抗体只有一条带，说明纯化过程中去除了杂蛋白；与Marker比较，抗体分子量在83 kD左右（图4）。

2.5.2 免疫亲和柱层析纯化抗体活性鉴 定四管洗脱液中均有抗CL的活性抗体存在，效价最高达105（图 5）。

Fig.3 Antibody activity after ascites salt-out

Fig.4 Result of SDS-PAGE after antibody purification by immunoaffinity chromatography

Fig.5 Antibody activity after immunoaffinity chromatography

2.6 标准曲线确定

标准曲线线性良好，曲线方程 y＝1.265-0.658 x，R2＝0.9812，IC50＝14.554 ng／mL，计算后得到ELISA方法最低检出限为 1.0 ng／ml（图 6）。

Fig.6 ELISA standard detection curve to CL

3 讨论

本实验确定了自制的克伦特罗单克隆抗体的生物学特性，验证了其具有较高的活性和亲和力。对腹水型单克隆抗体进行纯化，纯化后抗体的活性比之前有所降低，经分析认为：一是经纯化去除了与抗原非特异结合的抗体；二是在柱平衡过程中，会有一部分有效抗体未与柱结合而流失掉了；三是纯化后抗体被稀释，由于以上三方面的因素，使得抗体活性降低。通过实验证明了此单抗针对BSA及克伦特罗的结构和功能类似物几乎无交叉反应，因此具有较高的特异性。

用免疫分析技术（ELISA）检测克伦特罗比用气相色谱-质谱法（GC-MS）和高效液相色谱法（HPLC）检测克伦特罗更加简便，而且灵敏度更高，费用低廉。本研究通过间接竞争ELISA法确立了检测克伦特罗的标准曲线，为今后用免疫分析技术检测样品中克伦特罗及制备克伦特罗免疫检测试纸条和试剂盒奠定了基础并提供了依据。

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