康艾注射液对大鼠巨噬细胞酶活性的影响*

陈涵斌，应丽丽，赵灵灵，项一轩，林刻智，王 卫

（1.温州医科大学附属第一医院，2.温州医科大学病理教研室，3.温州医科大学仁济学院，浙江温州325015）

康艾注射液是一种运用于临床的抗癌辅助用药，选用黄芪、人参和苦参素，经过先进的生产工艺制备而成的中药注射液。黄芪属补气中药，含有多种氨基酸、微量元素等多种有效成分。人参为历代常用的益气扶正药，其化学成分和药理实验表明，具有抑制肿瘤细胞增殖、浸润和转移的作用，并能增强巨噬细胞和自然杀伤细胞的吞噬、杀伤活性，提高机体免疫力，促进骨髓代谢，增加白细胞生成，与放疗、化疗药物并用可防止白细胞下降。苦参素有清热解毒、抗菌消炎、调节免疫和抗肿瘤等作用。目前国内关于康艾注射液的研究，主要集中在缓解化疗药物的毒副作用和增强肿瘤患者免疫功能方面。然而康艾注射液增强患者的抗肿瘤免疫机制尚未明确，未见康艾注射液对巨噬细胞作用的文献报道。本文以大鼠肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages，AM）及 腹 腔 巨 噬 细 胞 （peritoneal macrophages，PM）内乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）为指标，研究康艾注射液对大鼠巨噬细胞酶活性影响，并观察胸腺、脾脏形态改变，为开发中药类新的机体免疫增强剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组及处理

健康雄性SD大鼠24只（温州医科大学实验动物中心提供），体重180～200 g，随机均分成2组（n＝12）：对照组和实验组，分2笼饲养。给大鼠称重，实验组按5 ml／kg·d腹腔注射康艾注射液（长白山制药股份有限公司，国药准字 Z20016868），对照组注射等容积生理盐水。两组大鼠均用复合饲料饲养30 d。观察实验动物一般情况，每天在规定时间内称量大鼠体重并观察饮食、皮毛、活动状况和反应等。

1.2 AM及PM的灌洗与培养及破碎

分别取上述实验组及对照组大鼠，股动脉放血处死大鼠，无菌室内，常规消毒。原位灌洗大鼠AM和PM，每只大鼠每次从气管内注入4℃生理盐水10 ml，轻轻按揉肺部3 min，抽回灌洗液重复3次。腹腔注入4℃生理盐水20 ml，轻轻按揉腹部3 min，抽回腹腔液重复3次。同组动物所得的AM及PM灌洗液分别离心，2 000 r／min，15 min，弃上清液后用Hank’s液再次离心洗涤，弃上清液后沉淀之细胞团用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液分别调节AM、PM浓度至2×106cells／ml，以每瓶1 ml分装至培养瓶内，置37℃培养箱内培养［1，2］。取上述经37℃贴壁培养2 h的AM与PM，弃上清液及非贴壁细胞用37℃生理盐水轻轻洗涤1次后每瓶内加入1 m l三蒸水，置低温冰箱内-80℃、80℃反复冻融5次，每次30 min，制成破碎的巨噬细胞悬液。

1.3 AM与PM内微蛋白含量、LDH、GSH-Px和 i-NOS酶活性的生化检测

BCA法测超微蛋白含量，生化试剂盒检测法测定其LDH、GSH-Px和iNOS酶活力，操作均严格按照相应试剂盒使用说明和文献［3］进行（超微蛋白含量、LDH、GSH-Px和 iNOS酶活性生化检测试剂盒均购自南京成生物工程研究所）。酶活力单位采用国际单位（U），LDH活力单位定义为：每毫克蛋白37℃与基质作用15 min，反应体系中产生1μmol丙酮酸为1 U。GSH-Px活力单位定义为：每毫克蛋白37℃，每分钟扣除非酶反应的作用，使反应体系中GSH浓度减低1μmol／l为1 U。iNOS活力单位定义为：每毫克蛋白每分钟生成1 nmol NO为1 U。

1.4 AM与 PM内 ACP、SOD和 SDH酶活性的ELISA法检测

利用ELISA竞争法测定AM与PM内ACP、SOD和SDH酶活性，操作步骤均严格按照相应试剂盒使用说明进行（ACP、SOD和SDH的ELISA检测试剂盒均购自上海蓝基生物公司）。

1.5 大鼠胸腺和脾脏组织形态学的制备

股动脉放血处死大鼠，迅速分离胸腺和脾脏，将每只大鼠胸腺和脾脏纵切，取3 mm厚小块组织放入10%中性福尔马林固定液中固定，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，制成厚度为4 μm切片，苏木素-伊红染色，中性树胶封固，光镜观察胸腺和脾脏组织结构形态变化。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠一般情况

对照组大鼠皮毛光滑，身体较壮，反应灵敏，饮食、活动、体重增长正常；实验组动物皮毛有光泽，身体健壮，反应非常灵敏，饮食、活动、精神状态明显比对照组好，体重有所增加。康艾注射液和生理盐水注射期间，各组大鼠体重呈持续上升的趋势，但两组体重差异无统计学意义（表1）。

Tab.1 Comparison of rat body weight between the two groups after one month（g，，n＝12）

Tab.1 Comparison of rat body weight between the two groups after one month（g，，n＝12）

NC：Normal control；EG：Experimental group

50±0.52 Group One day Ten days Twenty days Thirty days NC 198.67±5.43 245.08±0.79 285.17±0.83 327.00±0.73 EG 199.25±2.17 246.00±1.54 285.67±1.07 327.

2.2 光镜下各组大鼠胸腺和脾脏组织病理形态学变化

正常组脾脏由红髓和白髓组成，红髓由脾索和脾窦所构成，白髓包括动脉周围淋巴鞘、淋巴小结和边缘区构成，动脉周围淋巴鞘由少数几层淋巴细胞构成（图1A），淋巴小结致密、深染，未见生发中心（图1B）。和正常组相比，实验组动脉周围淋巴鞘增厚，淋巴细胞层次增加（图1C），淋巴小结体积增大，中央可见生发中心扩大（图1D，图1见彩图页Ⅰ）。

正常组胸腺由多个胸腺小叶构成，每个胸腺小叶由皮质和髓质组成，皮质由致密淋巴细胞构成（图2A），髓质由疏松结缔组织、散在淋巴细胞和巨噬细胞构成（图2B），并可见散在胸腺小体。实验组与对照组相比，胸腺形态上未见明显差异（图2C、2D，图2见彩图页Ⅰ）。

2.3 AM与PM中微蛋白含量、LDH、GSH-PX和i-NOS酶活性

实验组大鼠AM与PM内微蛋白含量、LDH、iNOS和GSH-Px酶活性明显高于对照组，两组间有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01，表 2、表 3）。

Tab.2 Comparison of rat AM micro protein content，LDH，GSHPx and iNOSenzyme activity between the two groups（，n＝12）

Tab.2 Comparison of rat AM micro protein content，LDH，GSHPx and iNOSenzyme activity between the two groups（，n＝12）

NC：Normal control；EG：Experimental group；AM：Alveolar macrophages；GSH-Px：Glutathione peroxidase；iNOS：Inducible nitric oxide synthase；LDH：Lactate dehydrogenase*P＜0.05，**P＜0.01 vs NCgroup

Group Proteinconcentration（μg／ml）GSH-Px（U）iNOS（U／ml）LDH（U／ml ）NC 109.46±6.28 42.08±2.10 0.42±0.015 22.29±0.98 EG 175.25±11.25*65.44±73.36**0.68±0.12* 37.42±1.28**

Tab.3 Comparison of rat PM micro protein content，LDH，GSHPx and iNOSenzyme activity between the two groups（，n＝12）

Tab.3 Comparison of rat PM micro protein content，LDH，GSHPx and iNOSenzyme activity between the two groups（，n＝12）

NC：Normal control；EG：Experimental group；PM：Peritoneal macrophages；GSH-Px：Glutathione peroxidase；iNOS：Inducible nitric oxide synthase；LDH：Lactate dehydrogenase*P＜0.05，**P＜0.01 vs NCgroup

Group Proteinconcentration（μg／ml）GSH-Px（U）iNOS（U／ml）LDH（U／ml ）NC 80.50±12.91 34.47±1.99 0.25±0.13 10.189±1.05 EG 138.47±8.49**51.11±2.91*0.48±0.041**19.26±5.62**

2.4 AM与PM中 ACP、SOD和SDH酶活性

实验组大鼠AM与PM内SDH、SOD和ACP酶活性明显高于对照组，两组间有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01，表 4、表 5）。

Tab.4 Comparison of rat AMACP，SODand SDH enzyme activity between the two groups（，n＝12）

Tab.4 Comparison of rat AMACP，SODand SDH enzyme activity between the two groups（，n＝12）

NC：Normal control；EG：Experimental group；AM：Alveolar macrophages；SDH：Succinate dehydrogenase；SOD：Superoxide dismutase；ACP：Acid phosphatase*P＜0.05，**P＜0.01 vs NCgroup

Group SDH（ng／ml）SOD（μg／ml）ACP（ng／ml ）NC 227.99±6.35 1.02±0.05 13.64±1.03 EG 270.09±15.51**1.22±1.23* 28.32±6.82**

Tab.5 Comparison of rat PM ACP，SOD and SDH enzyme activity between the two groups（，n＝12）

Tab.5 Comparison of rat PM ACP，SOD and SDH enzyme activity between the two groups（，n＝12）

NC：Normal control；EG：Experimental group；PM：Peritoneal macrophages；SDH：Succinate dehydrogenase；SOD：Superoxide dismutase；ACP：Acid phosphatase*P＜0.05，**P＜0.01 vs NCgroup

Group SDH（ng／ml）SOD（μg／ml）ACP（ng／ml ）NC 210.54±29.14 0.054±0.10 9.61±1.43 EG 248.73±8.80**0.084±0.07*17.68±0.97**

3 讨论

近年来中医中药及其提取物在保护机体脏器功能、提高机体免疫力方面的作用越来越受重视［4］。临床实践表明康艾注射液能抑制杀灭肿瘤细胞、减轻放化疗导致的骨髓抑制等不良反应、增强机体免疫功能［5］。

胸腺和脾脏分别为中枢淋巴器官和最大的周围淋巴器官。和正常组相比，实验组脾脏镜下见动脉周围淋巴鞘增厚，淋巴细胞层次增加，淋巴小结体积增大，中央可见生发中心扩大。动脉周围淋巴鞘为脾脏的T细胞区，淋巴小结为脾脏的B细胞区，上述形态学的改变，表明脾脏T细胞和B细胞均激活，在一定程度上分别增强细胞免疫和体液免疫功能。而胸腺为中枢淋巴器官，在T细胞发育成熟后其形态学改变不明显，在人类，青春期后，胸腺逐渐萎缩，故本实验两组胸腺形态上差异不明显。巨噬细胞是一种重要的抗原呈递细胞和免疫效应细胞，在免疫启动、调节和效应阶段都起到重要作用，并能够合成和分泌50多种具生物学活性的炎性产物，具有很强的吞噬作用和分泌功能［6］。但是未活化的巨噬细胞的吞噬杀伤作用有限，受到刺激的巨噬细胞进一步分化成熟为活化巨噬细胞，使细胞体积增大、活力增强、吞噬功能增强，多种酶活性显著增强。因此活化是巨噬细胞有效参与免疫监控的条件，是其实现多种功能的基础。

ACP是体内一种非特异性的溶酶体酶，参与肺部的防御反应，是巨噬细胞内最有代表性的水解酶之一。正常条件下，LDH存在于膜性结构完整的肺泡巨噬细胞的胞浆中，肺泡腔中含量非常少。当细胞受损伤或膜通透性增加时，LDH会大量逸至胞外，使细胞液外LDH活力增强。其功能是催化乳酸脱氢成为丙酮酸或丙酮酸还原为乳酸，即参与了能量物质的有氧氧化与无氧酵解，尤其是巨噬细胞在吞噬过程中其能量来源主要通过糖酵解途径，糖酵解过程中产生的乳酸使细胞内pH下降有利于溶酶体酶发挥作用，故LDH活性被认为是巨噬细胞被激活的标志之一。所以，有研究表明：巨噬细胞内LDH、ACP活性的升高被认为是巨噬细胞被激活的标志。本研究显示，相比对照组，实验组大鼠AM与PM内LDH、ACP活性均具有上调作用，提示康艾注射液对巨噬细胞有激活作用，揭示了康艾注射液通过激活巨噬细胞以增强机体的免疫力。

SOD和GSH-Px是组织的两种重要的抗氧化防御物质。SOD是机体重要的抗氧化酶类，可清除自由基，减轻氧化损伤，被称为生物体抗氧化系统的第一道防线［7-9］，SOD的高低可以间接反映机体清除氧自由基的能力。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化脂质还原的酶［10］，特异地催化GSH对过氧化氢的还原反应，还可清除活性氧及氧化硝酸盐等成分，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。张学会等［11］研究发现，人参皂甙、黄芪多糖等多种成分有促进脑组织中SOD和GSH-Px抗氧化酶活性的作用，加速脑组织中自由基的清除。本研究显示，相比对照组，实验组AM与PM内抗氧化酶GSH-Px活性和SOD活性升高，提示实验组巨噬细胞抗脂质过氧化作用增强，即康艾注射液提高了机体的抗氧化水平，减少了脂质过氧化产物对巨噬细胞胞膜的损伤，从而在一定程度上起到了保护细胞膜和提高机体免疫力的作用。证实了康艾注射液具有清除自由基、抗氧化损伤、保护生物膜等多种生物学活性。

NOS可分为结构型（cNOS）和诱导型（iNOS）。i-NOS是体内合成NO的主要限速酶，主要存在于巨噬细胞，它的活性变化直接影响NO的生成量和生物效应，其活性不受Ca2＋浓度的影响［10］。本研究显示，相比对照组，实验组大鼠AM与PM内iNOS活性升高，说明康艾注射液可改善巨噬细胞功能，在防治感染和提高机体免疫力中具有重要意义。

SDH是线粒体有氧呼吸反应的关键酶，参与三羧酸循环，为细胞的生存和活动提供能量，一般其活性高低可作为评价三羧酸循环运行程度的指标。一些病理情况下，线粒体损伤的加剧，最终会导致SDH活性下降［12］。SDH活性升高时，细胞物质转运、能量代谢功能增强，提高细胞正常生理功能活动。本研究显示，相比对照组，实验组大鼠AM与PM内SDH活性均升高，说明康艾注射液可为细胞的生存和活动提供能量，提高细胞正常生理功能活动。

康艾注射液可能是通过对巨噬细胞的激活，并由激活的巨噬细胞介导提高患者的免疫功能，而达到抗肿瘤的作用机制，这为康艾注射液作为用于癌症辅助用药奠定了理论基础。

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