青海湖裸鲤HIF-2α基因的克隆及其ODD功能域羟化分析*

低氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIFs）是低氧信号调控的重要转录因子，由一个α亚基和一个β亚基组成，其中α亚基对氧浓度敏感，是低氧调节中起主要作用的亚基，而β亚基对氧浓度不敏感［1］。目前发现的HIFs家族有三个成员：HIF-1、HIF-2和 HIF-3，研究表明在 HIF-1α氨基酸序列ODD域（氧依赖降解结构域）中，含有两个脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase domain proteins，PHD）羟化位点，其保守基序为LXXLAP（其中X为任意氨基酸），而在C-TAD域（羧基端转录激活区）中第851位为天冬氨基酸残基，该位点与HIF-1α转录活性有关，是保守氨基酸［2］。Ema［3］等在研究血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）表达调控时首次报道 HIF-2α，HIF-2α又称为内皮 PAS结构域蛋白1（endothelial PASdomain protein-1，EPAS-1），与 HIF-1α同源性最高，也是细胞低氧应答反应中重要的转录因子。

青海湖裸鲤（Gymnocypris przewalskii）（以下简称裸鲤），属硬骨鱼纲鲤形目（Cypriniforms），鲤科（Cyprinidae），裂腹鱼亚科（Schizothoracinae），裸鲤属（Gymnocypris），仅分布在中国青海湖及其水系，是青海湖中唯一的水生经济动物，又称之为“湟鱼”，2004年在《中国物种红色名录》中列为濒危物种。

本文通过克隆青海湖裸鲤HIF-2α基因序列并对其ODD功能域进行羟化分析，为进一步研究青海湖裸鲤适应高原盐碱湖低氧环境的分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物材料 青海湖裸鲤样本从青海湖入湖河流捕获，取肝脏组织用于研究，样品保存于RNAlater液体中。

1.1.2 主要试剂 RNAiso Plus、PrimeScript Reverse Transcriptase、Ribonuclease Inhibitor、rTaq酶购自 TaKaRa公司，Transtaq酶购自TransGen公司，限制性内切酶、未预染蛋白质Marker购自 Thermo公司，Glutathione Resin购自 GenScript公司，GSTTag Mouse mAb购自Abmart公司，预染蛋白Marker购自New England Biolabs公司，Trx-Tag Monoclonal Antibady购自 Novagen公司，Goat Anti-Mous IgG、Goat Anti-Rabbit IgG、硝酸纤维素薄膜购自 Boster公司，Western blot一抗二抗去除液、BeyoECL Plus购自碧云天生物技术研究所，SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司，引物合成及序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。

1.1.3 引物设计 从GenBank中寻找鲤科鱼类HIF-2α基因序列，比对分析相关序列，根据序列保守区利用Oligo 7设计相关引物；通过裸鲤测序结果再设计其ODD功能域特异性引物（表 1）。

Tab.1Sequences of primers

1.2 实验方法

1.2.1 裸鲤cDNA的合成和裸鲤HIF-2α基因序列扩增 参照RNAiso Plus总RNA提取试剂说明操作，提取裸鲤肝脏组织总RNA；参照 PrimeScript Reverse Transcriptase说明操作，以oligo dT（RT-PCR）或接头引物 GR3AD（3’RACE）将总 RNA反转录成cDNA，用于HIF-2α基因序列扩增。PCR总体积25μl，其中 10×Tans Taq buffer 2.5μl，Tans Taq（5 U／μl）0.15μl，dNTP（2.5 mmol／L）2μl，上下游引物各 1μl，cDNA 1μl，用双蒸水补齐。扩增条件：94℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 2 min，30个循环，割胶回收目的条带，测序验证。

1.2.2 序列生物信息学分析 应用GenBank数据库中HIF-2α序列分析其保守结构，应用Clusta W2，DNAMAN和Mega 6等软件对青海湖裸鲤HIF-2α序列进行比对分析及系统发育进化树分析。

1.2.3 裸鲤HIF-2αODD功能域扩增及表达载体的构建

PCR扩增青海湖裸鲤HIF-2αODD功能域，SalⅠ和NotⅠ双酶切，构建pGEX-4T-2-ODD原核表达载体，测序验证。将pGEX-4T-2-ODD质粒转化大肠杆菌Rosetta中，阳性鉴定后直接用于表达或加甘油保存至-20℃备用。

1.2.4 裸鲤HIF-2αODD功能域羟化作用分析 培养200 ml pGEX-4T-2-ODD表 达 细 胞，isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside（IPTG）诱导，超声波破碎，离心后取上清，各加入50μl GST Resin，4℃孵育 3 h，离心回收柱子。用结合液（20 mmol／L Tris（pH 8.0），100 mmol／L NaCl，1 mmol／L EDTA，0.5%NP-40）将柱子洗脱两次，弃上清。再用反应缓冲液（20 mmol／L Tris（pH 7.5），5 mmol／L KCl，1.5 mmol／L MgCl2）洗涤三次。用一定量反应缓冲液将沉淀重新悬浮，平均分装成两管，一管为对照组，另一个管实验组。每管各加入500μl反应液（含有100 μmol／L 2-酮戊二酸，100μmol／L-抗坏血酸，50μmol／L FeCl2，100μmol／L二硫苏糖醇的反应缓冲液），混合均匀，30℃预热5 min。向实验组加入500μl纯化并透析过的斑马鱼PHD3蛋白（本实验室制备），对照组加入等体积的反应液，混合均匀，30℃反应2 h。反应完全后，将样品在4℃条件下，10，000 r／min离心5 min，弃上清。再用预冷1×PBS缓冲液洗涤三次，弃上清。最后用50μl 10 mmol／L还原性谷胱甘肽洗脱液洗脱目的蛋白，收集上清。取30μl上清，进行蛋白变性处理，Western blot检测。

2 结果

2.1 裸鲤HIF-2α基因序列的扩增

根据其它鲤科鱼类HIF-2α基因对比分析，通过HIF-2α基因序列保守序列设计引物，进行基因扩增，获得单一扩增条带（图1-A）。根据裸鲤HIF-2α基因序列已知片段，对HIF-2α基因3’端序列设计引物，进行基因扩增，获得较单一扩增条带（图 1-B）。

2.2 裸鲤HIF-2α基因序列及氨基酸序列分析

裸鲤 HIF-2α扩增长度为 3 013 bp，利用 NCBI的 ORF Finder程序对序列做开放性阅读框分析，经分析其开放阅读框（ORF）分别为2 502 bp，分别编码833个氨基酸（GenBank登录号为KJ921650）。将裸鲤HIF-2α氨基酸序列与斑马鱼、草鱼、胭脂鱼、武昌鱼、人及小鼠的序列进行对比，分析表明其氨基酸全序列一致性分别为：85.22%、88.20%、77.71%、87.25%、55.61%及54.93%。同时，裸鲤 HIF-2α氨基酸序列与裸鲤HIF-1α具有46%的一致性。在裸鲤HIF-2α中的ODD区域中，预测的脯氨酸羟化位点符合LXXLAP的保守基序（X代表任意氨基酸），而C-TAD区中羟化酶FIH的作用位点天冬酰胺Asn851同样保守，表明青海湖裸鲤HIF-2α的氧依赖调节途径可能与其它脊椎动物基本相似。

Fig.1 RT-PCR（A）and RACE（B）products of Naked carp hypoxia inducible factor-2α （HIF-2α）resolved by agarose gel electrophoresis

2.3 裸鲤HIF-2αODD功能域蛋白表达及纯化

将含有重组表达载体pGEX-4T-2-ODD的Rosetta菌株诱导表达并纯化，SDS-PAGE电泳结果显示，诱导的GST-ODD蛋白大小为35 KD，符合预期蛋白分子量大小。GST-ODD重组蛋白部分为可溶性表达，GST resin纯化获得的目的蛋白纯度较高（图2A）。

2.4 Western blot检测分析

以与GST resin孵育结合的GST-ODD重组蛋白作为底物进行羟化反应，产物洗脱后分别用Anti-GST和Anti-Trx抗体检测GST-ODD及Trx-PHD3（图2B）。GST-ODD实验组能检测到Trx-PHD3的存在，表明GST-ODD能通过酶／底物相互作用与Trx-PHD3结合。

Fig.2 SDSPAGE analysis and hydroxylation assay of recombinant GST-ODD

3 讨论

HIF-1α和 HIF-2α结构相似，均含有 bHLH、PAS、ODD和TAD区域。同时，二者的氧依赖降解途径也很相似，在常氧条件下，PHDs以氧和α-酮戊二酸为底物，将一个氧原子以羟基的形式对HIF-αODD区两个保守基序“LXXLAP”中的脯氨酸进行羟基化（HIF-1α：P402／P564；HIF-2α：P405／P531），另一个转移到α-酮戊二酸形成琥珀酸和CO2［4］。羟化的 HIF-α随后被pVHL识别并由泛肽标记，进入蛋白降解途径。在低氧状态下，不发生脯氨酸羟化反应，HIF-α与ARNT形成二聚体，进入细胞核，与低氧诱导基因启动子或增强子部位的HRE元件结合，与辅助转录因子CBP／p300一起促进靶基因的表达。但HIF-1α和HIF-2α使用的羟化酶不同，HIF-1α降解主要依靠PHD2，而HIF-2α降解主要依靠PHD3。

序列分析表明，青海湖裸鲤HIF-1α与HIF-2α氨基酸序列具有约46%的一致性，与哺乳动物基本相似，但二者在ODD功能域第二个Pro羟化基序存在一定的差异。青海湖裸鲤 HIF-1α为 PEMLAP［5］，不符合 LXXLAP保守基序；而青海湖裸鲤 HIF-2α为 LETLAP，与其它脊椎动物一样，符合LXXLAP保守基序。一般认为，HIF-1α主要参与对急性低氧的应答，而HIF-2α是慢性低氧或较高海拔低氧的主要调节者。我们推测，在青海湖裸鲤长期适应高原低氧盐湖环境过程中，两种HIF-α羟化位点的差异可能分别发挥不同的重要作用。

本实验成功原核表达了青海湖裸鲤HIF-2αGST-ODD融合蛋白，通过PHD3羟化酶处理，发现该融合蛋白能通过酶／底物作用与PHD3结合，表明GST-ODD蛋白能被PHD3羟化酶识别并羟化，提示青海湖裸鲤HIF-2α的ODD域没有发生类似HIF-1α的羟化位点变异，能够被PHD3正常识别并结合，这为进一步研究和比较青海湖裸鲤HIF的调控机制及下游靶基因作用机理，提供一定的分子生物学依据。

［1］ Semenza G L.HIF-1：Mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia［J］.J Appl Physiol（1985），2000，88（4）：1474-1480.

［2］ Rahman M S，Thomas P.Molecular cloning，characterization and expression of two hypoxia-inducible factor alpha subunits，HIF-1αand HIF-2α，in a hypoxia-tolerant marine teleost，atlantic croaker［J］.Gene，2007，396（2）：273-282.

［3］ Ema M，Taya S，Yokotani N，et al.A novel bHLH-PASfactor with close sequence similarity to hypoxia-inducible factor 1αregulates the VEGF expression and is potentially involved in lung and vascular development［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（9）：4273-4278.

［4］ Kaelin Jr WG，Ratcliffe P J.Oxygen sensing by metazoans：The central role of the HIF hydroxylase pathway［J］.Mol Cell，2008，30（4）：393-402.

［5］ Cao YB，Chen XQ，Wang S，et al.Evolution and regulation of the downstream gene of hypoxia-inducible factor-1αin naked carp（gymnocypris przewalskii）from Lake Qinghai，China［J］.J Mol Evol，2008，67（5）：570-580.