高铁血红素对心肌缺血／再灌注损伤的防护作用及其机制*

陈晓明，汤碧娥，孙玮明，汪 洋△

急性心肌梗死死亡率高，目前临床常用溶栓疗法和经皮穿刺腔内冠状动脉成形术治疗急性心肌梗死，一方面挽救了大量濒临死亡的心肌，但又引起了不容忽视的心肌缺血／再灌注损伤（ischemia／reperfusion，I／R）。研究发现，I／R损伤过程中心肌细胞发生严重的Ca2＋平衡紊乱，而细胞内Ca2＋超载导致的一系列钙依赖性酶的激活可能是引起心肌损伤的主要原因［1］。Calpain是一类Ca2＋激活的中性蛋白酶，参与细胞骨架调节、信号转导以及细胞凋亡等生理和病理过程。近年来研究发现，心肌I／R时，这种钙依赖性的蛋白酶的激活，是导致心肌死亡、功能受损的主要原因［2］。

高铁血红素在心血管系统中表现出强大的细胞保护作用。高铁血红素可减轻兔体外循环后心肌I／R损伤［3］；降低氧化应激诱导的血管功能障碍［4］。虽然已证实高铁血红素具有心肌保护作用，但其作用机制是否通过影响再灌注心肌calpain的活化还不明了。故本实验旨在大鼠急性I／R模型上，观察高铁血红素在calpain对心肌I／R损伤中的作用，并初步探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 动物和药品

SD大鼠，雄性，体重230～250 g，购自浙江大学医学院实验动物中心。高铁血红素、锌原卟啉IX、calpain抑制剂MDL28170、氯化三苯基四氯唑购自美国Sigma公司。Calpain和caspase3活性检测试剂盒购自Promega公司。Calpastatin抗体购自Santa Cruz公司。其他试剂均为国产分析纯。改良 Krebs-Henseleit（K-H）成分如下（mmol／L）：NaCl 118，NaHCO325，K2PO41.2，KCl 4.7，MgSO41.2，，CaCl21.25，葡萄糖 10.0，pH 7.4。

1.2 实验分组

64只雄性SD大鼠随机8组（n＝8）。假手术组（sham）：取离体心脏灌流，冠脉左前降支下穿线不结扎。I／R组：离体心脏缺血 40 min，再灌注 30 min。MDL28170＋I／R组（MDL＋I／R）：离体心脏于再灌注0～5 min给予 calpain的抑制剂 MDL28170（10μmol／L），其余与 I／R组相同。单纯 MDL28170组（MDL）：取离体心脏灌流，冠脉左前降支下穿线不结扎，30 min后给予 MDL28170（10μmol／L）灌流 5 min。高铁血红素 ＋I／R组（hemin＋I／R）：离体心脏 I／R前 24 h，大鼠腹腔注射50 mg／kg高铁血红素。单纯高铁血红素组（hemin）：大鼠腹腔注射50 mg／kg高铁血红素，24 h后取离体心脏灌流，冠脉左前降支下穿线不结扎。锌原卟啉IX＋高铁血红素＋I／R组（ZnPP＋hemin＋I／R）：离体心脏 I／R前 24 h，大鼠先腹腔注射 25μg／kg锌原卟啉 IX，20 min后再注射 50 mg／kg高铁血红素。单纯锌原卟啉IX组（ZnPP）：大鼠腹腔注射25μg／kg锌原卟啉 IX，24 h后取离体心脏灌流，冠脉左前降支下穿线不结扎。前4组大鼠在实验前腹腔注射生理盐水。

1.3 离体心脏I／R模型

雄性SD大鼠用戊巴比妥钠（60 mg／kg）腹腔麻醉后，开胸并迅速取出心脏，用预冷的改良K-H液洗去血液后，采用Langendorff灌流法，用改良K-H液灌流，灌流液事先用95%O2＋5%CO2饱和，灌注压为76 mmHg，温度37℃。从心耳向左心室内插入水囊，用生物信号采集系统检测心室内压的变化，记录左室发展压 （left ventricular developed pressure，LVDP）。采用结扎冠脉的左前降支40 min作为缺血，以松开结扣30 min作为再灌注。

1.4 心脏梗死面积测定

实验结束后，在左前降支原结扎处重新结扎，将1%伊文斯蓝注射入主动脉。然后将左心室纵向平均切成6片，用1%氯化三苯基四氯唑孵育15 min后，切片扫描。计算心肌梗死面积（%）＝灰白色的梗死区面积÷（红色的非梗死区面积＋灰白色的梗死区面积）×100%

1.5 乳酸脱氢酶测定

再灌注30 min后立即收集冠脉流出液，用全自动生化分析仪测定冠脉流出液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的活性。

1.6 血红素氧化酶（heme oxygenase，HO）活性测定

取左心室心尖部，制成10%匀浆液。取20μl心肌匀浆液、加入等体积的肝组织匀浆液，2倍体积的2 mmol／L高铁血红素和 4.5 mmol／L还原型辅酶Ⅱ（NADPH），混匀后再加入1.8 ml含镁的磷酸盐缓冲液，于37℃避光反应10 min。用双波长法于464 nm和 530 nm处测定胆红素生成量（pmol／mg·h）。

1.7 Calpain和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase 3）活性检测

Calpain和caspase 3活性检测参照Promega操作手册，用多功能荧光分析仪Wallac 1420 Explorer检测。测得的相对光单位反映calpain和caspase3的活性。

1.8 Western blot检测calpain蛋白表达

取左心室心尖部加入组织裂解液裂解，离心取蛋白沉淀。Lowry法测蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳后，蛋白转移至硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉封闭硝酸纤维素膜2 h，洗膜后加入Calpastatin一抗，4℃反应过夜，次日洗膜，随后加入辣根过氧化物酶标记二抗，室温反应1 h。洗膜，加入ECL显色剂，X片显影。以β-actin为内参。用Quality One图象分析软件，根据光密度定量分析。

1.9 统计处理

各组资料以均数±标准差（¯x±s）表示，用Prism 5.0软件采用 one-way ANOVA以及 Newman-Keuls post hoc test做统计学分析。

2 结果

2.1 Calpain在I／R心肌损伤中的作用

与假手术组比，心肌 I／R后 calpain、caspase 3活性明显增高（P＜0.01，表1）。心肌I／R后LDH释放量增加，LVDP明显下降，心肌梗死面积增大（P＜0.01，表 2）；而在缺血前和再灌注期给予 calpain的抑制剂MDL28170，可对抗I／R大鼠LDH释放量和Caspase 3活性的增加，LVDP的下降，心肌梗死面积的增大（P＜0.01，表 1、表 2）。与假手术组相比，单纯MDL28170组各指标无明显变化。

2.2 高铁血红素对I／R心脏各指标的影响

大鼠预先给予高铁血红素后，心脏HO-1活性增加（P＜0.01，表 1）。与 I／R组比，高铁血红素 ＋I／R组 calpain和 caspase 3活性下降（P＜0.01，表1）；LDH释放量减少，LVDP明显增高，心肌梗死面积缩小（P＜0.01，表 2）。与假手术组相比，单纯用高铁血红素组对正常心肌无明显损伤作用。

Tab.1 Changes of calpain，caspase 3 and heme oxygenase（HO）activities in different groups（¯x±s，n＝8）

Tab.2 Changes of LDH，left ventricular developed pressure（LVDP），and infarct size in different groups（¯x±s，n＝8）

2.3 锌原卟啉IX对高铁血红素保护作用的影响

实验前24 h给予HO-1的抑制剂锌原卟啉IX后，能对抗高铁血红素的保护作用，表现在，与高铁血红素＋I／R组相比，高铁血红素＋锌原卟啉IX＋I／R组calpain和caspase 3活性增高，LDH释放量明显增加，LVDP明显下降，心肌梗死面积增大（P＜0.01，表 1、表 2）。与假手术组相比，单纯铁原卟组对正常心肌无明显损伤作用。

2.4 Calpastatin在高铁血红素心肌保护作用中的地位

心肌I／R后，心肌calpastatin表达量明显低于对照组，高铁血红素＋I／R组与单纯 I／R组相比，Calpastatin表达量增高，而HO-1的抑制剂锌原卟啉IX可取消此作用（P＜0.05，表 3）。

3 讨论

Calpain是一种钙激活的中性半胱氨酸蛋白酶，生理条件下以非活性形式存在于胞浆中。心肌I／R时，胞内游离Ca2＋浓度增加，calpain由胞浆转位至细胞膜并被激活。活化的calpain在细胞凋亡中具有重要的作用［5］：calpain激活后可裂解 Bax产生18 kD的高效促凋亡的片段（Bax／p18），后者转位到线粒体，导致线粒体渗透性改变、细胞色素 C释放和caspase级联激活；在内质网应激导致的细胞凋亡途径中，calpain激活还可导致caspase-12活性增加，继而活化 caspase-9、3或者裂解抑凋亡Bcl-xl分子的“loop”环使之成为促凋亡蛋白导致细胞凋亡。本实验发现，大鼠心肌I／R后，calpain活性增加，而再灌注早期给予calpain抑制剂确实可以减少细胞凋亡的发生，缩小心肌梗死面积，促进心功能的恢复。

Tab.3 Expression of calpastatin protein in different groups（¯x±s，n＝3）

HO在哺乳动物体内有2种亚型，其中HO-2是原生型的酶，而HO-1主要由诱导产生。诱导HO-1活性增加，被认为具有强大的对抗氧化应激的作用，在不同的组织器官中均表现出强大的细胞保护作用［6］。近年来的研究表明，HO-1的抗细胞损伤作用与calpain活性的抑制有一定的关系。如Chen等人在人脐静脉内皮细胞高糖模型上的证实，高糖环境可诱导细胞发生calpain依赖性凋亡，而葛根素可通过诱导HO-1表达，抑制高糖诱导的calpain激活，减少细胞凋亡的发生［7］。钙蛋白酶抑素calpastatin是目前最为明确的一种内源性calpain抑制蛋白。糖尿病小鼠模型上的研究也表明，calpastatin过表达可通过抑制calpain激活，减轻糖尿病小鼠心肌I／R损伤，促进再灌注期心功能的恢复［8］。我们的实验发现，大鼠心肌I／R后calpastatin表达明显下降。此现象与早期Pedrozo等人在新生乳鼠心肌细胞缺氧再复氧模型上的报道一致［9］。高铁血红素预处理后I／R心肌calpastatin表达增加，calpain活性明显受抑制，而HO-1抑制剂可取消此作用。提示，高铁血红素可能通过抑制I／R心肌calpastatin表达的下降，减少calpain的激活，从而对抗心肌损伤。

综上所述，高铁血红素预处理可减轻大鼠心肌I／R损伤，其机制可能与诱导 HO-1，增加 calpastatin蛋白表达，抑制calpain的激活有关。

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