缺血后处理对缺血／再灌注大鼠心肌基质金属蛋白酶-2表达的影响*

卢彦珍，王 佳，宋 娟，张翠英，冀菁荃，李宝红，田小霞，宋晓亮

近些年来，随着冠状动脉搭桥术和经皮冠状动脉腔内成形术等冠脉再通术的迅速开展，缓解了缺血性心血管疾病，却带来了副作用即再灌注性损伤，它不但损伤心肌本身，还损伤了心肌间质。心肌间质构成一个复杂、广泛的胶原网络，将心肌细胞连接在一起，使单个心肌细胞和肌束的机械收缩偶连在一起，从而协调心肌的收缩和舒张。胶原的破坏必将影响心肌功能。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是结构上与锌相关的肽链内切酶家族，是细胞外基质的主要生理性调节物质，在基质成分合成和降解的过程中起着重要的作用。有研究报道［1］，心肌MMPs于心肌缺血早期即被激活，通过对心肌胶原的分解代谢，参与心肌缺血／再灌注损伤过程。大量研究表明缺血后处理（ischemic postconditioning，IPTC）具有明显缩小心肌梗塞面积、抗再灌注心律失常、改善心功能等与缺血预处理（ischemic postconditioning，IPC）相似的抗心肌缺血／再灌注（ischemia／reperfusion，I／R）损伤保护作用［2，3］，但目前的研究基本上集中在对心肌细胞的保护上，我们前期的研究显示［4］，IPTC对心肌间质有保护，但对MMPs有何影响未见报道。本研究旨在探讨IPTC对I／R大鼠基质金属蛋白酶-2的影响，并观察其与心肌间质和心功能的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 琼脂糖购自 Promega公司，羊抗鼠MMP-2多克隆抗体、鼠抗小鼠β-actin单克隆抗体、碱性磷酸酶标记的二抗IgG购自Santa Cruz公司，RT-PCR检测试剂盒购自Takara公司。

1.1.2 动物分组和模型制备 雄性SD大鼠24只，体重（250±30）g，用 20%的乌拉坦（1g／kg ip）麻醉后随机分为 3组（n＝8）：⑴缺血／再灌注（I／R）组，结扎左冠状动脉前降支20 min，解除结扎灌注40 min；⑵假手术对照（sham control，SC）组；右冠状动脉前降支仅穿线不结扎。⑶缺血后处理（IPTC）组，按Zhao［5］等的方法复制缺血后处理动物模型，即缺血毕，再灌注30 s、缺血30 s，连续3个循环，然后再灌注40 min结束实验。复制模型的可靠性用连续监视心电图Ⅱ导联的变化来判断，结扎后心电图ST段抬高，解除结扎血管复通后ST段下降1／2以上为模型成功。

1.2 方法

1.2.1 左室功能测定 从右颈总动脉插入 PE-50软质塑料导管至左心室，接压力传感器，经生理仪输出左心室压力（left ventricular pressure，LVP）信号，接计算机程序处理后，记录各组缺血前和再灌注40 min左心室峰压（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室内压上升及下降最大速率（the maximum rate of left ventricular pressure rise and fall，±dp／dt max）及Ⅱ导心电图。

1.2.2 心肌中胶原含量测定 按文献方法［6］称取冻存左室心肌约100 mg，脱水、脱脂、烘干、称重，加入 6 mol／L HCl 3 ml，105℃烘箱烤 16 h。冷却后调pH为 6，加去离子水至 10 ml，以 3 500×g，10 min离心，取2 ml上清液做检测。按要求配制标准管和空白管，用 Beckman紫外分光光度计，波长550 nm，1 cm光径，水调零，测各管A值，计算出羟脯氨酸含量。由于羟脯氨酸在胶原中占13.4%，心肌胶原含量（mg／g干重心肌）＝羟脯氨酸含量 ×7.46。

1.2.3 血浆MDA含量及SOD活性测定 各组于实验结束时，分别从左颈总动脉取血2 ml，以2 000×g，10 min离心分离血浆，硫代巴比妥酸法测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。

1.2.4 Western blot免疫印迹检测各组心肌 MMP-2蛋白的表达变化 取液氮冻存心肌匀浆、离心，取上清得MMP-2提取液，用Bradford法蛋白定量，每泳道取20μg蛋白于8%SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳后，将蛋白转移至PVDF膜上。加入多克隆羊抗鼠MMP-2的抗体 IgG（终浓度为 mg／L），37℃孵育 2 h，洗涤后，加入碱性磷酸酶标记的MMP-2兔抗山羊单克隆 IgG（1∶1 000稀释），37℃孵育 2 h，洗涤后，按试剂盒说明染色后拍照分析。

1.2.5 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测MMP-2mRNA在心肌的表达 采用Trizol一步法提取心肌组织总RNA，用紫外分光光度仪行RNA定量检测。MMP-2及内参照β-actin引物参照基因库基因序列设计。引物序列MMP-2（327 bp）上游引物5＇-CACCTATACCAAGAACTTCC-3＇，下 游 引 物 5＇-AACACAGCCTTCTCCTCCTG-3＇；β-actin（233 bp）上游引物5＇-GGACTTCGAGCAGGAGATGG-3＇，下 游 引 物 5＇-GCACCGTGTTGGCGTAGAGG-3＇。取 2μg总 RNA行RT-PCR，94℃变性 40 s，54℃ 退火 1 min，72℃延伸1.5 min，经35个循环。取10μl RT-PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳，利用Quantity One凝胶分析系统对扩增产物条带进行扫描，计算MMP-2 mRNA相对于内参β-actin的表达量。

1.3 统计学处理

实验所得数据以均数±标准差（¯x±s）表示，用SPSS14.0软件包进行统计分析。多组间比较应用单因素方差分析，组间两两比较应用q检验。

2 结果

2.1 IPTC对心肌I／R损伤时心脏动力学参数的影响

心脏动力学参数是代表心脏功能的重要指标。I／R组左室收缩压（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室内压最大上升速率（maximum rate of intraventricular pressure rise，±dp／dt max）低于假手术组，两者相比有显著差异（P＜0.01），说明 I／R组心脏功能明显受损；IPTC组三项指标明显高于I／R组（P＜0.05，P＜0.01，表 1），表明 IPTC组心脏功能明显改善。

Tab.1 Effects of IPTC on dynamic parameters of rat heart in three groups（¯x±s，n＝8）

2.2 大鼠心肌胶原含量和血浆MDA含量、SOD活性的变化

I／R组心肌胶原含量明显减少，血浆MDA含量增高，SOD活性降低，与SC组比较差异有显著性（P＜0.05，P＜0.01）。而与 I／R组相比，IPTC组心肌胶原含量明显升高，血浆MDA含量降低而SOD活性增强（P＜0.05，P＜0.01，表 2）。

Tab.2 Changes of myocardial collagen fibers and MDA、SOD of plasma among three groups

2.3 Western blot、RT-PCR测定 MMP-2表达结果

Western blot结果显示，缺血20 min再灌注40 min后，心肌组织中 MMP-2（3.6±0.98）表达较对照组明显升高（P＜0.01），IPTC组 MMP-2（2.3±0.71）的表达显著降低（P＜0.01，图 1）。RT-PCR法检测MMP-2 mRNA表达，SC组有少量MMP-2 mRNA表达（0.25±0.08），I／R组心肌表达明显增多（0.89±0.06），而 IPTC组表达明显低于 I／R组（0.53±0.09）（P＜0.01，图 2、图 3）。

Fig.1 Expression of MMP-2 proteinSC：Sham control：I／R：Ischemic／reperfusion；IPTC：Ischemic postconditioning；MMP-2：Matris matris metalloproteinase-2

Fig.2 RT-PCR of MMP-2 in SC group，I／R group and IPTC groupSC：Sham control：I／R：Ischemic／reperfusion；IPTC：Ischemic postconditioning；MMP-2：Matris matris metalloproteinase-2

Fig.3 RT-PCR of MMP-2 mRNA of SC group，I／R group and IPTCgroupMMP-2：Myocardium matris metalloproteinase-2；SC：Sham control；I／R：Ischemic／preperfusion；IPTC：Ischemic postcnditioning**P＜0.01 vs SCgroup；＃＃P＜0.01 vs I／R group

3 讨论

随着心血管疾病，特别是缺血性心脏病发病率的升高，缺血性心脏病已成为严重危害人类健康的心血管流行病。尽快开通闭塞的冠状动脉，有效恢复缺血心肌的血液灌注，是减少缺血心肌细胞损伤和恢复心肌收缩功能的根本措施，也是限制和缩小梗死面积、改善预后的关键所在。但随着急性心肌梗死的溶栓以及经皮冠状动脉介入术等有效恢复缺血心肌血液供应的治疗技术的兴起，大量基础和临床研究证实，缺血心肌的再灌注本身也会诱发一系列新的病理生理变化，进一步加重心肌细胞损伤，出现再灌注心律失常、心肌舒缩功能障碍、代谢异常以及心肌超微结构改变等，即发生心肌的缺血／再灌注损伤，直接影响病人的预后。因此，如何减轻缺血／再灌注损伤、最大限度保护缺血心肌、是有效治疗缺血性心脏病的关键。

由Zhao等［5］于 2003年首先提出的 IPTC，具有明显缩小心肌梗塞面积、抗再灌注心律失常、改善心功能等与IPC相似的抗缺血／再灌注损伤作用［2］，且由于其可控性好，操作方便引起广大心血管病学者的兴趣，但目前的研究基本上集中在对心肌细胞的保护上。心肌是由心肌细胞和心肌胞外间质成分（extracellular，ECM）构成，ECM是维护心脏结构和功能完整性不可缺少的重要组成部分［7］，对心肌细胞起支持、保护、营养、润滑和制约作用，心肌间质的损伤必将导致心脏形态改变和功能障碍。

心肌间质主要由胶原纤维及糖蛋白组成，胶原中I型胶原占80%～85%，Ⅲ型占11%，其余是少量的Ⅳ、V、Ⅵ胶原。这些胶原在心肌细胞间组成精细的网状结构。其主要功能有：（1）包绕在心肌细胞周围，为心肌细胞提供支撑网架，并在心肌细胞和毛细血管之间起连接作用；（2）形成心室的骨架组织，协调心肌收缩所产生张力的传导；（3）胶原纤维自身与心肌纤维呈现一定的排列方向，有利于防止心肌细胞错位，重排及肌节过度伸展，维持心室的几何形状；（4）胶原纤维还可在心肌收缩期贮存能量，有利于心室舒张期充盈的伸展。已有研究表明，心肌缺血／再灌注后，虽然没有心肌细胞的坏死，血液供应也得到了恢复，但心肌舒缩功能尚不能及时恢复，其原因可能与心肌间质的损伤、降解有关。Zhao等［8］用扫描和透射电镜观察，发现 I／R后心肌的胶原支架稀疏，不连续或缺失，包绕心肌细胞束的胶原网松散或缺失。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一组能特异地降解细胞外基质成分的锌（Zn2＋）依赖的酶家族，主要分为胶原酶、明胶酶、基质溶解素及膜型MMPs等几类，其主要功能是参与细胞外基质的降解，可降解除多糖以外的所有ECM。最近大量动物及临床研究发现MMPs的表达及活性增强与心肌缺血／再灌注损伤有着密切的关系。

本实验结果显示，I／R组心肌MMP-2蛋白活性和MMP-2 mRNA的表达均明显升高，这与文献报道一致［9］。同时，心肌羟脯氨酸含量明显降低，表明心肌缺血／再灌注后胶原降解。在心肌胶原含量明显减少时，心功能三项指标LVSP、±dp／dt max明显低于假手术组（P＜0.01），表明MMP-2的释放和活性的增加与心肌间质的破坏和心功能损害有明显的相关性。与I／R组比较，IPTC组MMP-2活性和MMP-2 mRNA的表达均显著降低（P＜0.01），在 MMP-2降低的同时，心肌胶原含量增加，反映心脏收缩功能的LVSP、＋dp／dt max及反映心脏舒张功能的-dp／dt max明显改善（P＜0.05，P＜0.01），提示 ITPC具有抑制MMP-2的表达和活性的作用，且对心肌的保护作用之一可能是通过抑制MMP-2的活性和表达，减轻了心肌间质的损伤实现的。

IPTC抑制I／R心肌MMP-2的活性和表达增加的机制尚不清楚。有研究表明心脏在缺血／再灌注后产生大量氧自由基，氧自由基可诱导基质金属蛋白酶原的构象改变，使其暴露催化部位而激活［10］。我们发现I／R组MMP-2的活性和MMP-2 mRNA表达增加的同时，血浆中的SOD也明显降低而MDA明显升高，提示缺血／再灌注过程中体内氧自由基增加或清除能力不足必将导致心肌基质金属蛋白酶激活，使心肌胶原降解和破坏。而IPTC的心肌保护作用可能在于增加了SOD的活性，增强了机体的抗氧化能力，稳定了基质金属蛋白酶，从而减少心肌间质胶原的降解而保护了心脏功能。

综上所述，本研究结果显示：（1）MMP-2的表达及活性增强是心肌缺血再灌注心肌间质损伤的机制之一。（2）IPTC对心肌的保护作用之一可能是通过减少自由基产生，抑制MMP-2的活性和表达，减轻了心肌间质的损伤而实现的。

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