高湿环境对大鼠免疫功能的影响*

郭 鑫，李 昆，王 超，李 薇，杨 芸，宋富强，呼永河

高湿环境能引起人体常见的多种疾病，高湿度是导致这些疾病的重要因素及发病条件［1］。我国幅员辽阔，气候环境复杂多变，尤其是南方和沿海地区，大部分处于中、亚热带气候，常年多雨，丛林分布广，湖泊及河流密布，或者接近海洋，水资源丰富。这些地区全年湿度均偏高，高湿致病因素影响的范围极为广阔。近年来，随着SARS、禽流感等与湿度因素相关的新的疾病的出现，使得高湿环境下导致疾病的病因学及病理机制的研究显得更为紧迫和重要。免疫力是机体抵御疾病的屏障系统，了解高湿条件下机体免疫力的改变，有利于为改善高湿引起各种疾病的状况提供新的思路。前期的研究认为，湿度变化可能是影响人体免疫功能的重要因素［2，3］，然而，高湿环境下机体免疫力到底如何变化，其随着时间的发展又会有怎样的结果，目前并不十分清楚。本研究对不同湿化时间的大鼠模型进行免疫学方面的检测，旨在探讨其变化的规律及意义，并为高湿影响机体免疫功能机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

健康 SD雄性大鼠30只，体重（200±20）g，由四川达硕实验动物公司提供。异硫氰酸荧光素（FITC）标记小鼠抗大鼠CD3单抗，R-藻红蛋白（R-PE）标记小鼠抗大鼠 CD4单抗，别藻蓝蛋白（Allophycocyanine）标记小鼠抗大鼠CD8单抗购自美国BECKMAN公司。固定剂及红细胞裂解液购自德国PARTEC公司。人工气候箱为RXZ-1000A型，由中国宁波江南仪器厂制造。流式细胞仪购自德国PARTEC公司CYFLOW ML型。全自动生化分析仪为日本OLYMPUSAU400。

1.2 高湿模型建立

将30只健康雄性SD大鼠分为三组（n＝10）：常温常湿组、湿化20 d组和40 d组，其中湿化组大鼠放入人工气候箱培养，湿度（RH）为（90±2）%，温度（T）为（26±2）℃，每日刺激 10 h，其余时间条件与常温常湿组大鼠相同，分别于20 d、40 d处死，采集血液和脾脏标本。常温常湿组条件 RH＝（55±5）%，T＝（26±2）℃。

1.3 外周血T淋巴细胞亚群测定

采集高湿组和常温常湿组大鼠外周静脉血，EDTA抗凝。（1）取抗凝血25μl分别加人各流式检测管中，然后分别加人荧光素标记的抗大鼠单克隆抗体 CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC，并设立同型对照和空白对照，室温避光孵育30 min；（2）加入 30μl固定剂，混匀后室温避光放置15 min；（3）加入2 ml溶血素，避光 37℃水浴 30 min，待测；（4）采用 PARTEC公司CYFLOW ML型流式细胞仪，同时开启蓝色和红色激光器，接收数据通道为 FL1、FL4和 FL5，在FLOMAX2.8软件下获取与分析数据。以 FSC／SSC设定淋巴细胞门，根据对照调整好实验参数，每管检测1万个细胞。

1.4 脾组织T淋巴细胞亚群测定

采集高湿组和常温常湿组大鼠脾脏于培养皿中，PBS冲洗3次。外科手术剪反复剪碎后，用200目筛网过滤收集细胞，并于4℃，2 000 r／min离心10 min，弃上清；加入2 ml溶血素重悬细胞，静置5～10 min，4℃，2 000 r／min离心 10 min，弃上清；加入 PBS重悬细胞，4℃，2 000 r／min离心 10 min，弃上清；加入PBS，重悬细胞后，取20μl按照外周血的方法进行标记和固定，最后调整细胞数为1×106cells／ml，上机检测，每管检测1万个细胞。

1.5 血清 IgG、IgA、IgM抗体及补体 C3水平的检测

采集高湿组和常温常湿组大鼠外周静脉血2 ml，4 000 r／min离心 10 min，取血清在全自动生化分析仪上，用透射比浊法检测。检测试剂、校准品及质控均为原装配套试剂，质控结果在允许范围内才能进行实验检测。

1.6 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件，所有结果均采用均数±标准差（¯x±s）表示，组间比较采用 t检验进行分析。

2 结果

2.1 外周血T淋巴细胞亚群测定结果

湿化大鼠外周血总的T淋巴细胞水平变化不大，其比例均为50%左右，与常温常湿组相比没有显著性差异。CD4＋的T淋巴细胞比例在20 d组显著上升，与常温常湿组相比有统计学差异，而40 d组CD4＋的T淋巴细胞比例也升高，但与常温常湿组相比没有统计学的差异。CD8＋的T淋巴细胞比例随着时间的推移，呈现了先降低再升高的趋势，其中20 d组在统计学上有显著性差异，40 d组则与常温常湿组细胞比例几乎一致。CD4＋／CD8＋结果与CD4＋的T淋巴细胞亚群结果类似，在20 d组显著升高以后，40 d组持续降低，最终数据结果接近常温常湿组的水平（表1，图1）。

Fig.1 Flow cytometry results of Tlymphocyte subsets in peripheral blooda：FS vs SStwo parameter scatter diagram；b：CD4-PC7 vs CD3-FITC two parameter scatter diagram；c：CD8-APC vs CD3-FITC two parameter scatter diagram；d-f：CD3-FITC、CD4-PC7、CD8-APC single parameter histogram

2.2 脾组织T淋巴细胞亚群测定结果

湿化大鼠脾脏CD3＋T淋巴细胞结果显示，20 d组比例降低，40 d组升高，但与常温常湿组相比均没有统计学差异。CD4＋T淋巴细胞结果趋势与CD3＋T淋巴细胞类似，随着时间推移先降低再升高，与常温常湿组相比无统计学差异。CD8＋T淋巴细胞20 d组结果与常温常湿组有统计学差异（P＜0.05），比例显著降低，40 d组亦降低，但无统计学差异。CD4＋／CD8＋在20 d组与40 d组的水平均略有升高，但与常温常湿组相比均没有显著性差异（表2，图 2）。

Fig.2 Flow cytometry results of T lymphocyte subsets in spleena：FS vs SS two parameter scatter diagram；b：CD4-PC7 vs CD3-FITC two parameter scatter diagram；c：CD8-APC vs CD3-FITC two parameter scatter diagram；d-f：CD3-FITC、CD4-PC7、CD8-APCsingle parameter histogram

2.3 血清IgG、IgA、IgM抗体及补体C3检测结果

湿化大鼠20 d组和40 d组血清IgG的含量均低于正常组大鼠，但未见统计学差异，而IgA与IgM变化不大。湿化大鼠20天组补体C3显著上升（P＜0.05），40 d组结果与正常对照组相比没有显著性差异（表 3）。

3 讨论

环境的应激对机体的免疫功能有一定的影响，普遍的观点认为，强烈而持久的应激可能会导致免疫功能的降低。高湿环境有其特殊的环境条件和致病机理，我国许多传统医学的研究者在湿度因素致病免疫学机理的研究中提出了许多宝贵经验。张六通等［4］研究发现，在相对湿度（RH）＞90%，温度（T）（18～25）℃，连续刺激 12 h／d，连续观察 108 d的条件下，高湿致病组大鼠出现T淋巴细胞总数不足、T淋巴细胞亚群异常以及白介素2活性下降，提示高湿可能导致了T淋巴细胞介导的细胞免疫功能的低下。陈刚［5］除对高湿模型大鼠进行了免疫功能的研究外，还设无菌组大鼠，即在相对无菌的环境中建立高湿模型大鼠，并进行相关免疫功能的研究，结果发现无菌组高湿模型大鼠亦存在免疫功能的紊乱，揭示外界湿度在没有微生物参与的情况下，也能对机体免疫功能产生较大影响。

T淋巴细胞是介导细胞免疫的主要效应细胞，T淋巴细胞亚群的比值是反映机体免疫功能变化的主要指标。正常状态下，T淋巴细胞及其亚群的数目在周围组织中相对稳定，而病理条件下，CD4＋／CD8＋的比值则可能发生变化，提示免疫功能发生紊乱。本实验研究发现，湿化大鼠外周血总的T淋巴细胞水平变化不大，而CD4＋T淋巴细胞在20 d组显著上升，CD8＋T淋巴细胞则显著降低，其比值显著升高。40 d组变化趋势与20 d组相似，但是差异不明显。这提示高湿环境在开始阶段作为一种应激因素对机体产生了刺激，导致免疫系统的自稳状态发生改变，CD4＋与CD8＋比例出现变化，其比值显著上升，免疫系统功能增强。这与 Carlini［6］等的研究结果一致，他们通过湿邪致病大鼠IL-2、IL-8水平变化探讨湿邪致病与细胞免疫功能的关系，发现外湿组的IL-2和IL-8水平比内湿组和常温常湿组明显升高，提示湿邪致病初期外湿与机体的免疫功能提高和炎症反应密切有关，此阶段机体可能对外在湿邪较内在湿邪的刺激更为敏感。之后随着时间的延长，机体对高湿刺激因素慢慢适应，可能逐渐习服，表现为CD4＋、CD8＋T淋巴细胞及其比值逐渐降低至常温常湿组水平。大鼠脾脏T淋巴细胞亚群整体变化不大，湿化20 d组大鼠CD8＋T淋巴细胞亚群有统计学差异，其数据显著降低，这进一步说明在高湿环境初期，机体免疫功能提高，杀伤性的T淋巴细胞发挥了直接的作用，此后随着机体的不断调整可能逐渐习服，T淋巴细胞亚群比例逐渐接近正常水平。

Tab.2 Levels of T lymphocyte subsets in spleen in control and high humidity groups（¯x±s，n＝10）

Tab.3 Results of humoral immunity index in blood serum of control and high humidity groups（g／l，¯x±s，n＝10）

体液免疫是机体免疫系统的重要组成部分，IgG、IgM、IgA等免疫球蛋白以及补体系统都对机体的免疫系统发挥了重要作用。实验结果显示，20 d组的C3有较大幅度地升高，有统计学差异。以往的研究表明，应激对补体的活性和含量起抑制作用［7，8］，这也提示我们，高湿应激可能不同于其余的应激因素，它能够显著提高机体C3的含量，在体液免疫总体降低的情况下，短效地提升机体的防御能力。随着时间的推移，机体通过自我调整，补体C3基本回复到正常状态，最终表现为与常温常湿组无显著性差异。

本研究说明了在高湿环境下大鼠机体内免疫状态的变化，即实验初期大鼠的免疫自稳状态发生变化，功能得以增强，随着时间的延长，机体通过自我的调整，可能逐渐习服，免疫功能降低到正常水平。这使我们初步明确了高湿环境对机体免疫功能的影响，并进一步了解了湿化时间与机体免疫状态的关系，对我们下一步研究高湿环境影响机体免疫功能的机制具有一定的指导意义。

［1］ 钟 梁，呼永河，张 聪，等.浅议高湿环境对人体生理心理的影响［J］.西南国防医药，2011，21（10）：1114-1115.

［2］ Wright HE，McLellan TM，Stapleton JM，et al.Cortisol and interleukin-6 responses during intermittent exercise in two different hot environments with equivalent WBGT［J］.J Occup Environ Hyg，2012，9（4）：269-279.

［3］ Jaakkola MS，Laitinen S，Piipari R，et al.Immunoglobulin G antibodies against indoor dampness-related microbes and adult-onset asthma：a population-based incident case-control study［J］.Clin Exp Immunol，2002，129（1）：107-112.

［4］ 张六通，梅家俊，黄志红，等.外湿致病机理的实验研究［J］.中医杂志，1999，40（8）：496-498.

［5］ 陈 刚.外湿模型大鼠免疫功能变化的研究［J］.中国现代医生，2007，45（11）：1-2.

［6］ Carlini Fan Hardi，张诗军，陈泽雄，等.基于 IL-2、IL-8水平变化的湿邪致病机理研究［J］.中国中医药咨讯，2010，2（1）：10-11.

［7］ Sunyer JO，Tort L.Natural hemolytic and bactericidal activities of sea bream Sparus aurata serum are effected by the alternative complement pathway［J］. Vet Immunol Immunopathol，1995，45（3-4）：333-345.

［8］ Rotllant J，Tort L.Cortisol and glucose responses after acute stress by net handling in the sparid red porgy previously subjected to crowding stress［J］.JFish Biol，1997，51（1）：21-28.