硫化氢延缓肾脏纤维化作用机制的研究进展

顾玉露， 章晓燕,2,3*

1. 上海市肾病与透析研究所，上海 200032 2. 复旦大学附属中山医院肾内科，上海 200032 3. 上海市肾病与血液净化重点实验室，上海 200032

·>综述·

硫化氢延缓肾脏纤维化作用机制的研究进展

顾玉露1， 章晓燕1,2,3*

1. 上海市肾病与透析研究所，上海 200032 2. 复旦大学附属中山医院肾内科，上海 200032 3. 上海市肾病与血液净化重点实验室，上海 200032

硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)在体内是一种内源性气体信号分子，在肾脏中表达丰富，在不同生理病理条件下发挥重要调节作用。肾脏纤维化时，H2S含量明显降低，补充外源性H2S可明显减轻纤维化程度。大量研究表明，H2S在肾脏纤维化过程中发挥保护作用，其机制包括抗炎症、抗氧化应激、抗上皮间质转化、调节细胞增殖与凋亡、抑制纤维母细胞活化等。

硫化氢；肾脏；纤维化；氧化应激；表观遗传

以往认为，硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)与其他氢氰化物一样可抑制细胞色素C氧化酶，从而被视为一种有毒气体。20世纪90年代，H2S被视为继一氧化碳(carbon monoxide，CO)和一氧化氮(nitric oxide，NO)之后的第3种气体信号分子。H2S具有调节血管紧张性、炎症反应、氧化应激、心肌收缩、胰岛素分泌等多种生理功能。近年来研究发现，H2S可延缓多种纤维化疾病的发展，如肺纤维化、肝脏纤维化、肾脏纤维化等。肾脏纤维化是多种慢性进展性肾脏疾病共同的结果。H2S可通过多种信号通路和分子机制延缓肾脏纤维化的发展。本文就H2S延缓肾脏纤维化的作用机制作一综述。

1 H2S的生成、代谢及其在肾脏中的生物学效应

1.1 H2S的来源 H2S在哺乳动物体内主要通过3种途径酶促合成：(1) 胱硫醚-β-合酶(cystathionine-β-synthase，CBS)催化L-半胱氨酸和L-同型半胱氨酸脱硫生成H2S；(2) 胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)催化L-半胱氨酸脱硫生成H2S；(3)半胱氨酸转氨酶催化L-半胱氨酸转氨形成3-巯基丙酮酸，而后经3-巯基丙酮酸转硫酶(3-MST)催化脱硫形成H2S[1]。30多年前，Stipanuk和Beck[2]发现肾内有丰富的H2S生成酶表达，并首次描述H2S通过半胱氨酸脱硫形成。研究发现，CBS是肾内催化主要H2S产生的酶[3]，表达于近端肾小管，而CSE散在表达于肾小球、间质和肾动脉[4-6]。

1.2 H2S的代谢 目前已知H2S在体内主要通过3种途径分解代谢：(1)H2S氧化生成硫代硫酸盐(thiosulfate，S2O32-)，然后在硫氰酸酶(thiosulfate:cyanide sulfurtransferase，TST)和亚硫酸盐氧化酶(sulfite oxidase，SO)催化下形成硫酸盐(sulfate，SO42-)，该过程主要发生于线粒体中；(2)H2S在硫醇甲基转移酶(thiol S-methyltransferase，TSMT)作用下发生甲基化，形成甲硫醇和二甲硫醚；(3)H2S与高铁血红蛋白结合形成硫化血红蛋白[7]。

1.3 H2S在肾脏中的生物学效应 H2S对维持肾功能发挥重要作用。在多种肾脏病中，血浆或肾内H2S水平均有明显降低，伴随血肌酐、尿素氮及尿蛋白的增加。Xia等[8]发现，H2S对肾小球和肾小管功能均发挥作用，通过向肾动脉内灌注低剂量硫氢化钠(NaHS)可显著增加肾小球滤过率、尿钠、尿钾排泄和肾滤过分数；高剂量NaHS增加肾血流量，其机制可能与扩张肾小球动脉和抑制肾小管离子通道有关，后者主要通过抑制Na+-K+-ATPase和Na+-K+-Cl2-共转运体实现，且H2S对肾小管的作用强于对肾血管的作用。

H2S可作为氧传感器监测肾髓质氧浓度及调节肾皮质的局部血流。在肾缺氧状态下，H2S通过增加髓质血流量、减少小管运输耗能、抑制线粒体呼吸等作用，维持氧平衡[1]。

2 H2S抗肾脏纤维化的作用机制

2.1 抗炎症反应 持续性损伤后的炎症反应激活纤维化起始过程，进一步引起基质细胞的活化和增殖[9]，因此有效的抗炎可缓解肾纤维化的发展。已发现H2S可通过减少炎性介质、降低细胞因子水平、抑制促炎酶(如诱导型一氧化氮合酶、环氧化酶-2)的活性，从而抑制炎症反应[10]。Song等[11]发现，单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠模型血浆H2S水平明显降低，肾间质巨噬细胞浸润增多；而腹腔注射低剂量NaHS可显著减少巨噬细胞浸润，降低白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的mRNA水平，从而缓解小管间质损伤，减轻纤维化程度。Jung等[12]在UUO大鼠模型中发现，外源性NaHS能抑制核转录因子-κB(NF-κB)的活化和降低Ly6G的表达，减少肾内白细胞浸润。由此推测，H2S通过抑制NF-κB的活化及降低炎症因子的表达，从而发挥其抗纤维化作用。但也有研究[13]发现H2S有促炎症作用。Liu等[14]发现，GYY4137(1种H2S慢释放剂)可加重顺铂引起的肾毒性损害，并伴有促炎因子如IL-1β的增加。H2S的抗炎或促炎作用可能与炎症反应的不同阶段和H2S供体种类(快释放剂和慢释放剂)有关[10]。

2.2 抗氧化应激 活性氧(reactive oxygen species，ROS)和氧化应激对肾脏纤维化的进展起重要作用，多功能抗氧化清除剂或抗氧化酶模拟物可有效缓解肾脏纤维化[15]。体外实验[16]发现，H2S可上调人肾脏系膜细胞和足细胞内抗氧化酶血红素加氧酶-1(heme oxygenase，HO-1)的表达。体内实验[12]发现，UUO模型鼠肾内过氧化物、丙二醛生成明显增多，4-羟基壬烯醛、锰超氧化物歧化酶、过氧化氢酶表达增加，而给予外源性NaHS后可减轻这些变化，且外源性NaHS可增加肾内总谷胱甘肽含量，降低氧化型谷胱甘肽与还原性谷胱甘肽比例。由此可见，H2S抗氧化应激的作用主要表现在增加抗氧化酶活性以及调节还原性谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比例。

核转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factor-E2 related factor-2 ，Nrf2)是一种调节抗氧化酶基因表达的核转录因子，在抗氧化应激中发挥重要作用[17]。H2S可能通过活化Nrf2通路发挥抗氧化应激的作用。研究[18]发现，经过NaHS处理的糖尿病肾病鼠体内Nrf2核表达增加，其下游目标Nrf2、HO-1、醌氧化还原酶1[NAD(P)H: quinine oxidoreductase 1，NQO1]也增加，同时超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性增强，ROS和丙二醛水平降低。

此外，H2S还可通过解离形成HS-直接清除ROS、其他非酶类抗氧化剂[如硫氧还原蛋白1(thioredoxin-1，Trx-1)]以及通过p66Shc依赖的信号转导通路抑制线粒体中ROS产生等途径发挥抗氧化应激作用[17]。

2.3 抑制上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT) EMT是上皮细胞失去细胞基底膜接触性和结构极性的过程，形态学上类似于间质细胞或肌成纤维细胞细胞表型的改变[19]。尽管EMT对肾纤维化发生的作用仍存在争议[20]，但一般认为小管上皮细胞是基质细胞的来源之一[9]，且EMT是肾纤维化发生的潜在机制[21]。研究[22]发现，GYY4137可抑制细胞的迁移，下调UUO模型鼠肾组织转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和其他EMT标志物表达，提示H2S可抑制EMT[22]。H2S可通过抑制胞外信号调节激酶(extracellular signal-related kinase，ERK)通路和Wnt/β-连环蛋白通路，抑制TGF-β1诱导的肾EMT过程[23]。此外，Lv等[24]在研究H2S抗乳腺癌细胞EMT的作用时发现，H2S降低p38磷酸化水平是其抑制EMT的潜在机制。

2.4 调节细胞增殖与凋亡 H2S可抑制肾纤维母细胞的增殖。Song等[11]研究发现，100 mmol/L的NaHS可以抑制10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)诱导的NRK-49F细胞数量增多，增殖相关基因增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、c-Myc蛋白表达也减少。可见，H2S能通过抑制DNA合成和下调增殖相关蛋白的表达抑制肾间质成纤维细胞的增殖。

H2S还可促进纤维母细胞的凋亡。研究[25]证实，NaHS处理人肺纤维母细胞可引起微核形成增加(提示DNA损伤)，使细胞周期停留在G1期，而不影响DNA修复蛋白如PCNA的表达；稳定p53及其下游蛋白如p21、Bax、细胞色素C，而不上调抗凋亡蛋白Bcl-2。因此，H2S通过诱导DNA损伤，抑制细胞增殖、稳定凋亡相关因子，从而促进纤维母细胞的凋亡。但是，H2S可抗实质细胞凋亡。研究[26]发现，NaHS可减少梗死心肌细胞的凋亡比例，使Bax表达减少、Bcl-2表达增加，从而增加Bcl-2与Bax比例；推测H2S可能通过增加抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白比例来抗肾实质细胞凋亡。

2.5 抑制纤维母细胞向肌成纤维细胞分化 正常情况下，纤维母细胞产生基线水平的细胞外基质以维持间质基质平稳，一旦受到促纤维化因子激活或外源性机械性刺激时，纤维母细胞获得肌成纤维细胞表型，表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，产生大量基质，导致肾脏纤维化的发展[9]。研究[11]发现，NaHS可抑制TGF-β1引起的胶原Ⅰ、α-SMA、纤连蛋白mRNA表达，以及Smad3和有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的磷酸化作用，提示H2S通过抑制TGF-β1-Smad和MAPK信号通路，而抑制肾纤维母细胞分化为肌成纤维细胞。Pan等[27]用NaHS处理促血管生成素2(angiopoietin2，Ang2)诱导活化的心肌纤维母细胞，发现H2S可抑制ERK1/2/NOX4/ROS信号通路，且可抑制Ang2诱导的心肌纤维母细胞向肌成纤维细胞分化，推测H2S对ERK1/2/NOX4/ROS信号通路的抑制作用可能是抑制心肌纤维母细胞活化的机制之一。

2.6 H2S的表观遗传学机制 研究[28]发现，H2S可维持线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)复制，其通过硫巯基化修饰转录抑制剂干扰素调节因子1(interferon regula-tory factor-1，IRF-1)抑制DNA甲基转移酶3a(DNA methyltransferase 3a，Dnmt3a)，引起线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)启动子去甲基化，增强TFAM的表达，从而增加mtDNA拷贝数量和线粒体标记基因表达。mtDNA异常复制可能损伤线粒体功能和结构。而线粒体功能障碍促进肾小管间质纤维化，减轻线粒体功能障碍能够延缓纤维化过程[29]。因此猜测H2S可能通过TFAM去甲基化维持正常mtDNA复制，以维持线粒体正常功能，从而发挥其抗肾脏纤维化作用。另有研究[30]发现，NaHS预处理可降低脂多糖诱导的炎症反应，其机制可能是抑制IL-6和TNF-α启动子区组蛋白H3乙酰化，抑制染色质开放性，从而下调IL-6和TNF-α的表达。

3 H2S抗肾脏纤维化的局限性

虽然H2S抗肾脏纤维化的作用已明确，但其对肾脏发挥保护作用的剂量范围仍未清楚。Song等[11]发现，高剂量的NaHS(560 μg·kg-1·d-1，腹腔注射)无抗肾纤维化作用，反而加重纤维化程度，伴肾皮质巨噬细胞浸润增多，MCP-1和TNF-α的mRNA表达增加，而低剂量组表现为明显的肾保护效应。

4 展 望

目前，H2S抗肾脏纤维化作用已在多项体内体外实验得到证实，但更深入的分子机制仍有待探讨。尤其是H2S在表观遗传学机制方面的作用值得深入探讨。然而，高剂量的H2S对人体有害、不能缓解肾脏纤维化；而剂量过低时，其抗纤维化效果较小。因此用于抗肾脏纤维化的外源性NaHS的剂量仍有待明确。另外，NaHS可引起体内H2S浓度快速升高，无法持续维持肾内有效的H2S浓度，因此寻找H2S慢释放剂显得尤为重要。目前用于肾脏的H2S供体有GYY4137和AP39，其对于抗肾脏纤维化的作用机制仍需更进一步研究。

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Mechanism of hydrogen sulfide delaying renal fibrosis: research progress

GU Yu-lu1, ZHANG Xiao-yan1,2,3*

1. Shanghai Nephropathy and Dialysis Institute, Shanghai 200032, China 2. Department of Nephrology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China 3. Key Laboratory of Nephropathy and Blood Purification of Shanghai, Shanghai 200032, China

As an endogenous gasotransmitter, hydrogen sulfide (H2S) is abundantly expressed in the kidney and plays an important regulatory role under different physiological and pathological conditions. In renal fibrosis, the level of H2S is significantly decreased, while supplement with exogenous H2S mitigates the severity of fibrosis. Many studies reveal that H2S plays a protective role in the development of renal fibrosis, and its mechanism includes anti-inflammation, anti-oxidation, inhibition of epithelial-mesenchymal transition, regulation of cell proliferation and apoptosis, and inhibition of fibroblast activation.

hydrogen sulfide; kidney; fibrosis; oxidative stress; epigenetics

2017-01-25接受日期2017-02-14

国家自然科学基金(81600579), 科技部国家科技支撑项目(2011BAI10B03), 上海市科学技术委员会自然科学基金(14ZR1406400). Supported by National Natural Science Foundation of China(81600579),National Key Technology Research and Development Program of Science and Technology Ministry of China(2011BAI10B03), and Natural Science Foundation of Shanghai Science and Techology Committee (14ZR1406400).

顾玉露, 硕士生. E-mail: 16211210007@fudan.edu.cn

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64041990, E-mail: zhang.xiaoyan@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170066

R 692

A

[本文编辑] 姬静芳