稳定表达绿色荧光蛋白肝癌大鼠肿瘤微转移时间窗的筛选

张 巍， 钱 晟， 朱 梁， 周 波， 杨国威， 刘 嵘， 瞿旭东， 王建华， 颜志平

复旦大学附属中山医院介入治疗科，上海市影像医学研究所，上海 200032

·论 著·

稳定表达绿色荧光蛋白肝癌大鼠肿瘤微转移时间窗的筛选

张 巍， 钱 晟， 朱 梁， 周 波， 杨国威， 刘 嵘， 瞿旭东*， 王建华， 颜志平

复旦大学附属中山医院介入治疗科，上海市影像医学研究所，上海 200032

目的： 探讨稳定表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的肝癌Buffalo模型大鼠肿瘤微转移时间窗。方法： 采用McA-RH7777/EGFP细胞株皮下注射成瘤后制备瘤块。取35只Buffalo大鼠，开腹直视下将瘤组织块种植到肝脏，制备大鼠肝癌模型。观察模型大鼠生物学行为，于种植后7、12、18、21、26 d检测大鼠肝功能后分别处死7只大鼠，荧光显微镜下观察肝内肿瘤生长情况、肺转移情况。结果： 种植后7 d行磁共振成像(MRI)扫描见大鼠肝内均有肿瘤提示造模成功。种植后大鼠体质量7 d内增长不明显，之后开始增加至21 d达高峰，随后开始下降。大鼠肝内肿瘤体积7 d时为(13.36±2.90) mm3，12 d时为(162.5±69.71) mm3，26 d时达(1 683.36±375.02) mm3。肝外转移情况：21 d时肺部出现荧光显微镜下可见的小转移灶，26 d时肺部出现肉眼可见多发小转移灶。肝功能检测发现26 d时白蛋白水平较前明显下降(P<0.05)。结论： 在稳定表达绿色荧光蛋白的肝癌Buffalo大鼠模型中，12～18 d为肝癌的微转移期，21 d后为晚期肝癌。

肝癌；分期；微转移；大鼠；绿色荧光蛋白

临床上肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的治疗总体分为手术治疗和非手术治疗。由于HCC早期症状不明显，绝大多数肝癌发现时已处于中晚期，无法进行有效的手术治疗[1]。对于符合手术切除的患者，术后复发率仍较高[2-3]。肝癌术前的准确分期对临床制定合适的治疗方案十分重要，对于抑制肝癌的转移和复发具有重要意义。

肝癌在生长过程中，癌细胞从原发灶脱落，进入淋巴系统、血循环、骨髓、肺等组织器官中，在相应的器官中生长成小于2 mm的微小肿瘤灶，此时无临床异常表现，称为微转移[4]。临床主要依据目前影像学手段所能发现的肿瘤转移病灶对肝癌进行分期，发现时患者已处于临床转移时期。在肿瘤细胞从原发灶脱落到出现临床影像学能够发现的转移病灶之间，必然有一个时间窗，即肝癌处于微转移的时期。了解这一时间窗具有重要的理论意义和临床意义。转移早期肿瘤病灶是一个比较容易在药物干预或其他干预下进入“休眠”状态的阶段。因此对于肝癌分期的深入研究能够提高分期标准，同时对患者治疗方案的制定、治疗效果的判断及患者的预后产生重要的影响。

对于肝癌的动物模型目前国内外有较多研究，但是关于肝癌动物模型的分期研究较少。本研究拟采用McA-RH7777/EGFP细胞株建立的Buffalo大鼠原位移植性肝癌模型，观察肿瘤的发生、发展，了解从较小的早期肝癌原位生长到出现影像学能发现的转移灶的时间窗，其中确立微转移的具体时间，初步探讨肝癌在大鼠模型上的肿瘤分期，为后续肝癌的研究提供基础，为临床肝癌治疗时机及方案的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞及动物 大鼠肝癌McA-RH7777细胞株(American Type Culture Collection公司)加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基(杭州四季青公司)，于5% CO2细胞培养箱中培养(37℃)。

近交系Buffalo大鼠购自美国Charles River Laboratory公司，8周龄，雄性，体质量为(219±11)g，由上海斯莱克实验动物公司繁殖，复旦大学附属中山医院动物实验中心饲养，SPF级。

1.2 主要试剂及仪器 胰酶消化液(美国Difco公司)；DMEM高糖培养基(杭州四季青公司)；PBS(上海碧云天生物技术有限公司)；Puromycin(美国Sigma-Aldrich公司)；1.5T超导磁共振成像仪(配小动物专用线圈，德国Siemens公司)；体视显微镜(日本Nikon公司)；Carestream多模式小动物成像系统(北京东胜创新生物科技有限公司)；荧光显微镜Leica M205(德国Leica公司)。

1.3 稳定表达绿色荧光蛋白的肝癌大鼠模型建立 参照文献[5]，对慢病毒载体进行包装，将携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的慢病毒对McA-RH7777细胞株进行转染，在含一定浓度Puromycin的培养基中进行筛选和单克隆化，构建出表达EGFP的单克隆细胞株(McA-RH7777/EGFP)。

用McA-RH7777/EGFP细胞株采用皮下注射方式在Buffalo大鼠皮下成瘤，成瘤后，制备成1 mm3大小瘤块。取Buffalo大鼠35只，麻醉后开腹直视下，将瘤块种植到Buffalo大鼠的肝左叶，制备大鼠肝癌模型。术后7 d进行磁共振成像(MRI)扫描了解成瘤情况，判定是否造模成功。

1.4 生物学行为变化 分别在造模当天及造模后记录大鼠体质量变化，观察大鼠的进食、毛色、粪便性状、活动状态及腹部体征等方面的变化。

1.5 大鼠肝肿瘤的变化 于大鼠进行造模后的7、12、18、21、26 d分别处死7只大鼠，记录肿瘤大小，并抽取下腔静脉血。大鼠处死后进行彻底尸体检查，观察原发灶情况，记录测算肿瘤大小。将瘤组织于10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，H-E染色，行病理学检测。肿瘤体积(V)=最大径(a)×最小径(b)2/2。

1.6 肝外转移情况的检测 造模后于第7、12、18、21、26天分别处死7只大鼠，进行彻底尸体检查，取网膜、肠管、肺、膈肌等器官于小动物成像系统及荧光显微镜下观察肝外转移情况，结合病理切片进一步观察。

1.7 肝功能变化 在造模后第7、12、18、21、26天在深麻醉下分别处死7只大鼠，处死前开腹，暴露下腔静脉抽血约2 mL，室温下3 000 r/min，离心15 min，取上层血清200 μL，放入EP管，-20℃保存。用全自动生化分析仪检测血清白蛋白(ALB)。

2 结 果

2.1 Buffalo大鼠移植性肝癌模型的建立 肝内接种后7 d，采用MRI扫描35只大鼠，均有肿瘤生长，成瘤率达100%，随着时间的延长，肿瘤逐渐增大，证实该模型的稳定性。

2.2 大鼠体质量及生物学行为变化 造模大鼠在术后第1天出现精神萎靡、觅食活动减少，但以上体征均在术后第3天消失，之后活动情况可持续随访最后处死的一组大鼠(7只)，发现第24天出现活动逐渐减少，反应迟钝，对刺激反应减弱，毛发没有光泽，其中有3只大鼠腹部肝脏肿瘤所对应的位置可见隆起的肿块，肿块固定，表面不规则，考虑为肝脏肿瘤侵犯腹壁所造成。

造模后7 d大鼠体质量为(224.57±14.47) g，与造模时体质量(217.71±11.32) g相比较无明显变化，随后体质量开始增长；持续观察最后一组大鼠(7只)，至21 d体质量达到(276.71±36.9) g，之后体质量不增长，开始下降，26 d时体质量为(265.71±46.63) g。

2.3 肝脏肿瘤的变化 第7、12、18、21、26天处死大鼠时测量肝肿瘤的长径、短径，根据公式计算体积。结果显示：从造模到第7天肿瘤增长缓慢，7 d时测量肿瘤体积为(13.36±2.90) mm3，12 d时较前明显增大，为(162.5±69.71) mm3(P<0.05)；之后肿瘤体积增长迅速，26 d时达到(1 683.36±375.02) mm3。

解剖发现第7天肿瘤较小，白色鱼肉样，无周边浸润；第12天肿瘤呈膨胀性生长，周边包膜完整，浸润不明显，肿瘤中央未见明显坏死；第18天发现肿瘤局部有浸润，肿瘤中心见少部分坏死灶；21 d后肿瘤明显增大，周边浸润，肝脏原位瘤与周围网膜、腹壁等发生轻微粘连；26 d肿瘤进行性增大，与腹壁、网膜粘连加重(图1、图2)。

2.4 肝外转移情况 造模后于相应时间点处死大鼠，每组进行彻底尸体检查。取网膜、肠管、肺、膈肌等器官于小动物成像仪及荧光显微镜下观察转移情况。解剖显示：在第18天前剖验大鼠未发现腹壁粘连，无网膜、肺、膈肌等转移；第21天剖验大鼠，发现有2只出现网膜包绕肿瘤所在部位，轻微粘连，易分离，网膜、肠管等未见转移灶，肉眼观察各个肺表面未发现转移灶，给予荧光显微镜下进一步观察，发现有1例出现单个微小病灶表达绿色荧光，直径小于0.1 mm，该病灶肉眼及普通显微镜下不可见，病理切片检查，发现其余地方有散在切片能见到的转移灶，但未发现直径0.5 mm以上的转移灶；第26天剖验发现有4只大鼠肝脏瘤块与腹壁粘连，腹壁见多发小结节状转移灶，肠系膜出现转移灶，1只出现少量腹腔积液，5只肺表面见多发转移灶，散在，肉眼可见，最大直径约1 mm，荧光显微镜下可见到其他肉眼未能显示的小转移灶(图1、图2)。

图1 荧光显微镜下观察所见

A1、A2为7 d时肝内肿瘤；B1、B2为12 d时肝内肿瘤；C1、C2为18 d时肝内肿瘤，周围开始浸润；D1、D2为21 d时肝内肿瘤；D3、D4为肺部表面普通显微镜看不到转移灶，荧光显微镜下发现表达绿荧光的微小转移灶；E1、E2为肝内肿瘤病灶明显进展；E3、E4为肺部多发转移灶；E5、E6为肠系膜转移灶. Original magnification: ×7.8 (D1, D2, E5, E6); ×14 (D3, D4)

图2 病理切片观察

A、B：肿瘤在第7、12天时周边包膜完整，分界清楚，L标注为正常肝组织，T为肿瘤组织；C：肝肿瘤浸润生长；D：随着肿瘤进展出现多发子灶(箭头)；E：肺转移灶；F：肠系膜转移灶. Original magnification: ×100

2.5 肝功能变化 在全自动生化分析仪上检测血清白蛋白(ALB)，分别记录第7、12、18、21、26天时的变化。结果发现21 d后ALB下降，但与之前各组相比差异无统计学意义[(36.57±2.37) g/L、(35.86±2.19) g/L、(35.57±1.81) g/Lvs(33.43±2.07) g/L]；在26 d时为(28.8±2.85)g/L，与之前各组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。结果提示随着肿瘤进展，肝脏代偿功能下降，状态逐渐恶化。

3 讨 论

HCC早期症状不明显，临床发现时多处于中晚期，患者往往失去手术机会，而且外科手术切除后的复发率较高。肝癌的转移和复发是目前影响肝癌预后的重要因素，肿瘤的转移是导致患者死亡的重要原因[6]。因此临床上准确地判断肝癌的分期尤为重要，针对不同分期选择不同治疗方案，对预后具有决定性的影响；不恰当的分期，会导致患者延误治疗或过度治疗。

在肝癌的研究领域，临床上采用的分期方法较多，存在的争论也较多。目前存在的分期方法主要有：美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)/国际抗癌联盟(International Union Against Cancer，UICC)提出的TNM分期以及巴塞罗纳工作组提出的BCLC分期等[7-9]。其中BCLC分期是Llovet等[10-11]从临床治疗角度提出的，依据肿瘤的大小、个数、Child-Pugh分级、门脉高压、有无血管侵犯、肝外转移等因素，将肝癌分为早期、中期、进展期、晚期，对每一个时期提出了具体的治疗方案，而且对于其预后有一定的评估，在临床工作中受到很多研究者的借鉴。

临床的肿瘤分期方法多是依据临床症状、化验结果、影像学检查(CT、MRI、PET-CT等)来确定。而肿瘤的进展是一个多因素、多步骤的动态过程[12]：原发灶的肿瘤细胞不断增殖，肿瘤新生血管生长；部分肿瘤细胞从原发灶脱落，侵袭基底膜进入血管、淋巴管向远处迁移；少数肿瘤细胞在侵袭和血流迁移过程中存活下来，到达其他部位或器官；肿瘤细胞穿出血管形成微小转移灶，肿瘤细胞继续增殖并产生新的血管，这些肿瘤生长后继续侵袭和转移。它涉及到细胞基因、黏附分子及细胞外基质(ECM)、肿瘤血管、机体免疫等多个环节。

因此，肿瘤在由极少的细胞生长至临床影像学所能发现的病灶之间，必然存在一个时间窗。UICC在肿瘤分期中指出：在肿瘤转移中，当远处转移灶增殖生长到直径1～2 mm时，称作微转移。在这个时间窗内肿瘤细胞播散并存活于淋巴系统、血液循环、骨髓、肺等原发病灶以外的器官中，形成微小的转移灶，直径小于2 mm，并且患者无任何临床表现，目前影像学手段如CT、MRI及病理学检查都很难发现[13-14]。了解这一时间窗具有重要的理论意义和临床意义。

肿瘤的微转移与患者的预后密切相关。Chen等[15]报道在61例行食管鳞状细胞癌根治术的患者中，检测其骨髓发现微转移阳性率21.3%(13例)，长期随访，发现微转移阳性者的中位生存期、5年无病生存率分别为13个月、7.7%，而骨髓微转移阴性患者的中位生存期、5年无病生存率分别为66个月、69.1%，从而证实骨髓微转移阳性的食管癌复发和转移率高，预后差。Dobashi等[16]对N0期非小细胞肺癌患者有淋巴结微转移灶和无淋巴结微转移灶两组进行随访，发现无淋巴结微转移灶组的5年生存率明显优于有转移灶组(87%vs21%)。

研究认为转移早期是一个比较容易在药物干预或其他干预下进入“休眠”状态的阶段，即肿瘤细胞处于不分裂增殖或分裂增殖与凋亡达到平衡状态。Nakanishi等[17]研究发现，对于皮下接种LacZ基因转染的Lewis肺癌细胞的小鼠给予不同剂量的替加氟口饲，发现替加氟可抑制接种癌细胞后早期小鼠(14 d内)肺内微转移灶的形成，但对于晚期小鼠(22 d后)则无显著抑制作用。结果提示微转移初期阶段的肿瘤对化疗敏感，药物可以有效抑制微转移灶形成。

肝癌实验研究中常用Walker-256细胞株接种SD大鼠及VX2细胞接种新西兰大白兔造模进行肝癌的动物实验研究，但这些均不是肝细胞癌，其实验研究结果应用于肝细胞癌的机制研究中有所欠缺。肝癌裸鼠模型由于缺乏免疫力，并且其动物较小，在影像学评价、介入治疗等方面的使用受到了局限。McA-RH7777细胞株是Buffalo大鼠低分化肝细胞癌细胞株，将McA-RH7777细胞接种于Buffalo大鼠肝内，在肝内进展特点与人类的HCC相似，能够分泌甲胎蛋白(alphafetoprotein, AFP)，有较高的肺转移率，另外该大鼠本身具有免疫性，而且体积合适，能够在介入、外科手术、影像诊断等研究方面作为模型，因此在肝癌的相关研究中受到重视[18]。

本实验模型中种植的肝癌细胞标记了GFP，其最大优点是GFP基因是整合到细胞的染色体中，细胞分裂后子代细胞持有的GFP量与母代完全一样，能够永久地标记不断分裂的肿瘤细胞，模型中非肿瘤细胞则不表达荧光[19]。因此其在血液、组织等中能够直观、准确地被检测到，对于明确肿瘤的进展，确定分期有重要意义。

本次实验肝功能中未检测转氨酶情况，考虑该肿瘤为移植型模型，无肝硬化及药物肝损等背景，在本研究所检测时间段内未必会发生变化，故未予检测。

本实验中造模后至第7天肝脏原位瘤较小，无肝外微小转移灶，肝功能、大鼠一般体征良好，可定为早期肝癌。在造模第7～12天时，肿瘤进行性增大，考虑进入外周血的肿瘤细胞只有少部分存活下来，观察其他部位并未发现表达荧光的转移灶，处于肿瘤逐渐进展并准备开始远处转移的阶段，考虑也可以归为早期肝癌。造模第12天后考虑随着原位癌的生长，更多的肿瘤细胞脱落进入血液循环，形成转移灶的机会大大增加，因此12～18 d这段时间可以定为肝癌的微转移期。造模后第21天肺部出现表达荧光的转移灶，白蛋白开始下降；26 d后大鼠进食等活动差，远处多发转移，出现腹腔积液，肝功能明显下降，出现恶液质倾向。因此根据模型观察，造模18 d后肿瘤细胞逐渐在远处定植，生长形成转移灶，造模第21天时出现表达绿色荧光的转移灶，相当于晚期肝癌。

肝癌的侵袭和转移是临床医师面临的现实难题，准确地确定微小转移灶，给予肝癌准确的分期，可以使肝癌能够尽早被发现，并得到合理治疗。在肝癌动物模型中，本研究结合原位癌、肝外转移灶、肝功能、大鼠的一般活动状态等方面因素，初步探讨了解肝癌的早期、微转移期、晚期的时间窗。依据这些分期，可以在不同的时期，评价相应治疗方案的疗效。如在造模12～18 d的微转移期，给予口服药物或动脉化疗栓塞治疗，来评价其对转移和复发的影响。该模型的分期方法在诸多方面与临床仍有很多不同，不能完全反映临床肝癌的进展情况，而且在不同动物种类及不同饲养环境等条件下，得到的分期标准有可能不同，但仍可为肝癌防治的基础研究提供一定参考。

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[本文编辑] 廖晓瑜， 贾泽军

Screen of time window of stable expression of enhanced green fluorescent for transplanted hepatocellular carcinoma in Buffalo rats

ZHANG Wei, QIAN Sheng, ZHU Liang, ZHOU Bo, YANG Guo-wei, LIU Rong, QU Xu-dong*, WANG Jian-hua, YAN Zhi-ping

Department of Intervention Radiology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai Insitute of Medical Imaging, Shanghai 200032, China

Objective： To discuss the time window of stable expression of enhanced green fluorescent for transplanted hepatocellular carcinoma in Buffalo rats. Methods： McA-RH7777/EGFP cells were subcutaneously implanted into the Buffalo rats' right thighs. Pieces of tumor tissue were implanted into the left lobes of the livers in 35 rats. The weights and serum albumin levels of rats were measured on day 7, 12, 18, 21, 26 after tumor implanted. The subsequent growth, metastasis of the implanted tumors were observed and evaluated with whole-body fluorescence optical imaging system, fluorescent microscopy. Results： The tumors were detected with MRI in all animals on day 7 after tumor implanted. There was no significant growth of weight within 7days, but increased significantly after and reached the peak value at day 21, then decreased. The mean tumor volumes was (13.36±2.90) mm3on day 7, (162.5±69.71) mm3on day 12, increased to (1 683.36±375.02) mm3on day 26 after tumor implanted. With the fluorescent microscopy, micrometastasis tumors can be detected in lungs on day 21 after tumor implanted. Multiple small lung metastases were detected on day 26. The albumin levels on day 26 after tumor implanted were significantly lower than before (P<0.05).Conclusions： The period from 12 to 18 days in the models may be classified as the micrometastasis stage, and it becomes advanced liver cancer after 21 days.

hepatocellular carcinoma; staging; micrometastasis; rat; enhanced green fluorescent protein (EGFP)

2017-01-22 [接受日期] 2017-05-07

国家自然科学基金(81171432)，复旦大学附属中山医院人才培养计划资助项目(2015ZSYYYXQN06,2015ZSYXGG18). Supported by National Natural Science Foundation of China (81171432) and Personnel Training Program of Zhongshan Hospital Affiliated to Fudan University (2015ZSYYYXQN06,2015ZSYXGG18).

张 巍，博士，主治医师. E-mail: zhang.wei6@zs-hospital.sh.cn

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64041990-2533, E-mail: qu.xudong@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170059

R 735.7

A