信号转导及转录激活蛋白4对脂多糖所致小鼠急性肺损伤的影响

刘 歆， 吴晓丹

1.福建省老年医院呼吸内科，福州 3500002.复旦大学附属中山医院呼吸内科，上海 200032

·论著·

信号转导及转录激活蛋白4对脂多糖所致小鼠急性肺损伤的影响

刘 歆1,2， 吴晓丹2*

1.福建省老年医院呼吸内科，福州 3500002.复旦大学附属中山医院呼吸内科，上海 200032

目的： 探讨信号转导及转录激活蛋白4(signal transducer and activator of transcription 4, STAT4)在细菌表面分子脂多糖(LPS)所致急性肺损伤(ALI)中的作用及可能机制。方法： 建立STAT4基因敲除小鼠模型，采用LPS诱导小鼠肺损伤并观察肺组织病理变化及血气分析变化，流式细胞仪分析外周血骨髓源性抑制细胞(MDSC)和调节性CD4+CD25+Treg细胞的变化情况，瑞氏染色观察肺部炎症细胞浸润情况。结果： 在LPS诱导的肺损伤模型中，STAT4基因敲除小鼠肺组织损害较野生型小鼠肺损伤减轻，动脉血氧合指数(PaO2/FiO2)高，病理评分降低，肺湿/干重比降低，外周血MDSC和CD4+CD25+Treg升高，肺部炎性细胞总数增加，中性粒细胞浸润增加(P<0.05)。结论： STAT4可加重LPS诱导的肺损伤，可能与MDSC及CD4+CD25+Treg细胞在外周血的比例升高有关。

信号转导及转录激活蛋白4；脂多糖；肺损伤

急性肺损伤(ALI)是各种直接和间接致伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，导致慢性肺间质及肺泡水肿，患者发生低氧性呼吸功能不全。其发展至严重阶段被称为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，是ICU中最常见的致死病因之一[1]。一项对1994年至2006年国际上正式发表的72项ALI/ARDS临床研究的荟萃分析[2]表明，11 426例ALI/ARDS患者的病死率为43%。我国上海市15家成人ICU中,2001年3月至2002年3月ARDS病死率也达68.5%[3]。目前认为，固有免疫应答过强是导致ALI/ARDS患者早期死亡的主要原因，而适应性免疫应答被抑制是患者晚期死亡的重要原因。

信号转导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription, STAT)是一类具有信号转导和转录调控功能的蛋白质家族，主要存在于胞质中。STAT由Janus激酶(JAK)激活，被激活后可以介导多种基因表达，同时也可抑制转录，广泛参与多种细胞的存活、生长和分化，在多种生理病理过程中起着关键作用[4]。现已发现，多种细胞因子可激活STAT信号通路，调节骨髓源性抑制细胞(MDSC)的生成和运动[5-7]。MDSC由髓系来源的未分化成熟的具有异质性的细胞组成，其中包括树突状细胞、巨噬细胞和粒细胞等。MDSC主要表达CD11b+Gr-1+，是具有免疫抑制功能的细胞群，各种炎症因子能诱导MDSC的产生、运动和活化，从而抑制机体免疫细胞以保持正常固有和特异性免疫功能[8]。鉴于MDSC对机体发挥固有免疫和适应性免疫有重要的影响，其被视为探讨肺损伤机制和探索相关干预策略的重要靶标。新的研究[9]发现，LPS刺激可使肺MDSC细胞聚集，参与肺内炎症反应的调节。

STAT4是STAT家族的新型成员之一，受IL-12的分泌调控，在机体抗炎过程中发挥重要作用[10]。LPS刺激后STAT4基因表达上调[11-12]。目前，STAT4信号对MDSC成熟及免疫抑制功能的作用仍缺乏研究，在调节Treg细胞中发挥何种作用尚不清楚。因此，本研究建立STAT4基因敲除小鼠模型，探讨STAT4基因敲除小鼠对LPS所致的肺损伤是否有抵抗作用及外周血MDSC、CD4+CD25+Treg细胞数量变化、肺部中性粒细胞和单核细胞比例在LPS刺激STAT4基因敲除小鼠中发生的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物来源及分组 BALB/c背景的野生型小鼠和STAT4基因敲除(STAT4-/-)小鼠，雄性，8～12周，体质量20～24 g。实验动物购自复旦大学医学院动物部，SPF级。饲养过程符合国家标准，通过复旦大学医学院动物部伦理审批。动物分为4组：野生型小鼠+0.9%氯化钠液；野生型小鼠+LPS；STAT4-/-小鼠+0.9%氯化钠液；STAT4-/-小鼠+LPS。

1.2 小鼠肺损伤模型的制备 每组小鼠各6只，选用5%水合氯醛7.2 mL/kg经腹腔注射麻醉。将麻醉后的小鼠固定于塑料平板上，然后将平板倾斜放置，经气管内给予LPS(5 mg/kg)，给药后立即左右摇动平板，使LPS均匀分布于左右两肺。对照组按相同方法给予同等剂量0.9%氯化钠液。12 h后将小鼠麻醉，取血、肺脏、脾脏，备用。

1.3 动脉血气分析 LPS(5 mg/kg)刺激12 h后，将小鼠麻醉，左心室采血。血气分析仪测定动脉血氧分压(PaO2)，并计算氧合指数(PaO2/FiO2)，评估肺的呼吸功能障碍。

1.4 支气管肺泡灌洗液收集 将2 mL量程注射器针头拔下，吸入1 mL PBS，经小鼠支气管反复冲洗3次，回收率不低于85%，此为肺泡灌洗液。收集的肺泡灌洗液1 000 r/min离心10 min，下层沉淀用于细胞涂片，瑞氏染色进行白细胞分类计数。滴加瑞氏染液染3 min，并使标本被其中甲醛所固定；加等量pH 6.4磷酸盐缓冲液(或等量超纯水)轻轻晃动玻片，均匀静置5 min；水洗、吸干、油镜下观察。组织细胞胞质红色，细胞核蓝色或紫色。计数每个视野中中性粒细胞数、单核细胞数、总白细胞数。

1.5 肺湿重/干重比 LPS(5 mg/kg)刺激12 h后，将每组小鼠左侧肺组织结扎取出，分别记录湿重后置于烘箱中69℃烘烤，72 h后取出，记录其干重，计算湿重/干重比。肺组织湿/干重比反映了肺组织水肿的严重程度，比值越大，炎症水肿程度越重。

1.6 肺组织形态学观察 将取出的左肺置于10%甲醛中固定后，制作石蜡切片，经H-E染色进行肺组织病理学评分。根据肺泡和间质水肿程度、中性粒细胞浸润程度、出血程度进行评分，具体评分标准见表1。该评分能从组织学上反映小鼠经不同处理后肺损伤程度。

表1 肺损伤评分标准

1.7 流式细胞仪分析外周血中免疫细胞变化 流式细胞检测外周血中CD11b+Gr-1+髓系细胞、CD4+CD25+Treg细胞数量变化和STAT4缺失对CD11b+Gr-1+髓系细胞分化的影响。红细胞裂解液摇床上裂解15 min，离心1 200 r/5 min，收集沉淀，流式抗体CD11b、Gr1、CD4、CD25(BD，美国)孵育1 h，重悬离心，用流式仪(BD，美国)进行检测。

1.8 荧光定量real time-PCR TRIzol法提取小鼠肺脏组织中RNA，反转录cDNA。STAT4 F：5′-CCA GGT CTG TGA TTG GCT CT-3′，R：5′-ACA TCC AGA GGA CCC CTT CC-3′；GAPDH F： 5′-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3′，R：5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3′。应用SYBR荧光定量方法测定小鼠LPS刺激后STAT4的mRNA相对表达水平。

2 结 果

2.1 各组小鼠肺组织湿/干重比的比较 LPS刺激后，STAT4-/-小鼠较WT小鼠肺损伤减轻；LPS刺激12 h后，STAT4-/-小鼠肺湿/干重比低于WT小鼠。在无LPS刺激的条件下，STAT4-/-与野生型小鼠肺湿/干重比差异无统计学意义。WT小鼠LPS刺激后肺湿/干重比较LPS刺激前升高；STAT4-/-小鼠刺激后肺湿/干重比与LPS刺激前差异无统计学意义(图1)。

2.2 各组小鼠氧合指数的比较 动脉血气分析结果显示，LPS刺激后STAT4-/-小鼠和WT小鼠氧合指数较LPS刺激前均减小，提示LPS对肺功能有急性损害作用。LPS刺激后，STAT4-/-氧合指数大于WT小鼠，说明STAT4-/-小鼠可抵抗部分LPS诱导的肺损伤(图2)。

图1 各组小鼠肺组织湿/干重比

图2 LPS刺激12 h后小鼠氧合指数变化

2.3 各组小鼠肺组织H-E染色结果的对比 LPS刺激后，WT和STAT4-/-小鼠肺间质增厚，肺泡融合成肺大泡，炎性细胞浸润明显，肺泡渗出明显，肺组织结构被破坏(图3)。与WT小鼠相比，STAT4-/-小鼠肺组织病理评分减小，损伤较WT组小鼠减轻，差异有统计学意义(P<0.05，图4)。

图3 各组小鼠肺组织H-E染色结果

图4 小鼠肺组织病理评分

2.4 各组小鼠肺泡灌洗液瑞氏染色结果 中性粒细胞在STAT4-/-小鼠肺组织中升高。白细胞总计数、中性粒细胞计数在LPS刺激后较刺激前增加，差异有统计学意义(P<0.05)；单核细胞计数较前略有增加，但差异无统计学意义。LPS刺激后，STAT4-/-小鼠较WT小鼠白细胞、中性粒细胞计数增加，差异有统计学意义(P<0.05)，单核细胞未见差异(图5)。瑞氏染色表明，中性粒细胞增多，但无法区分成熟的中性粒细胞和未成熟的中性粒细胞；中性粒细胞总数增加提示未成熟的CD11b+Ly6G+细胞可能增加。

图5 STAT4-/-和野生型小鼠肺泡灌洗液白细胞分类计数结果

A：瑞氏染色；B：瑞氏染色统计淋巴细胞数量柱形图；C：瑞氏染色统计中性粒细胞数量柱形图；D：瑞氏染色统计单核细胞数量柱形图. Original magnification: ×1 000(A).*P<0.05，**P<0.01

2.5 不同细胞亚群的流式细胞仪检测结果 全血流式细胞仪检测结果(图6)显示：在没有LPS刺激的情况下，STAT4-/-细胞与野生型差异无统计学意义；LPS刺激后，STAT4-/-小鼠的CD11b+Gr1+MDSC细胞较野生型增加，差异有统计学意义(P<0.05)；在CD11b+细胞中，以CD11b+Ly6G+粒系的MDSC变化为主；小鼠外周血中CD4+CD25+Treg细胞增加，差异有统计学意义(P<0.05)。

图6 全血流式细胞仪检测结果

3 讨 论

LPS诱导气道损害，炎症因子释放，是肺损伤最直接的诱发因素。研究[13]表明，炎症因子可激活巨噬细胞、树突状细胞等使STAT4表达增高。LPS诱导产生的IFN-α信号在促进STAT4表达升高中具有重要作用，STAT4这一依赖IFN-α信号可能与Th1细胞占优势相关[14]。本实验验证了LPS可通过增加STAT4表达水平诱导肺损伤。

应用STAT4基因敲除小鼠模型，本研究进一步明确了STAT4信号通路在LPS所致肺损伤中起重要作用，STAT4基因敲除可减轻LPS导致的肺损伤。血中CD11b+Gr-1+MDSC在STAT4基因敲除小鼠中增加，以粒系增加为主，Treg细胞在STAT4基因敲除小鼠LPS刺激后也产生明显变化，这提示STAT4通过调节MDSC和Treg细胞诱发肺损伤。

MDSC具有多种生物学功能，以促进肿瘤细胞的增殖和转移为典型生物学特征。根据MDSC细胞表型，将其分为粒系(Ly6G+Ly6C-)和单核系(Ly6G-Ly6C+)两种。研究[15]证明，粒系和单核系MDSC在炎症反应过程中发挥不同或相反的生物学功能。在LPS刺激的外周血MDSC变化中，STAT4基因敲除主要引起粒系MDSC，即不完全成熟的中性粒细胞变化。但是，粒系MDSC升高后如何进一步保护LPS所诱发的肺损伤尚未完全阐明。Matsukawa等[16]指出，在STAT4基因敲除小鼠体内，中性粒细胞趋化因子MIP-2、角化蛋白趋化物KC明显减低，髓过氧化物酶也有降低的趋势，这可能是STAT4基因敲除保护肺组织免受损伤的潜在机制。

LPS刺激后，CD11b+Gr-1+MDSC细胞迁移增加。De Wilde等[17]的研究也指出，LPS刺激后CD11b+Gr-1+MDSC细胞剧增，这些MDSC细胞分泌的IL-10增加。IL-10大量分泌提示Th1细胞反应较为强烈，可进一步加剧炎症反应[18]，进而诱导MDSC和Treg变化；Treg细胞又可分泌IL-10，进一步加重LPS诱导的肺损伤。在STAT4基因敲除小鼠中，这一免疫调控通路被破坏，LPS诱导的肺损伤减轻。本研究中，CD4+CD25+Treg细胞增加，与研究[19]结论一致。这表明STAT4-/-小鼠或可通过调节Treg细胞来抑制LPS诱导的免疫反应，即通过调节MDSC比例和分化来调控LPS诱导的肺损伤。MDSC根据其具有抑制T细胞免疫应答的能力而命名。CD11b、Gr1表达双阳性是这类细胞的表面分子特征。本研究中，LPS刺激后，STAT4敲除小鼠的MDSC中的粒系MDSC(CD11b+Ly6G+)升高，提示生物体内LPS通过STAT4信号通路调节MDSC的分化来加重肺损伤。

综上所述，本研究提示STAT4基因敲除可能通过促进血中CD11b+Gr-1+MDSC的聚集来抑制LPS导致的肺部炎症损伤。其中，MDSC通过增加肺部Treg细胞，发挥该细胞的免疫抑制作用。MDSC可能通过STAT4信号通路调节Treg细胞，进而减轻急性肺损伤。降低STAT4表达水平有望成为治疗细菌性肺损伤的潜在靶点。MDSC与Treg细胞之间是否存在关联尚不明确，有待下一步研究。

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[本文编辑] 廖晓瑜， 贾泽军

Effect of STAT4 on LPS induced acute lung injury of mice

LIU Xin1,2, WU Xiao-dan2*

1. Department of Respiratory Medicine, Gerontal Hospital of Fujian Province, Fuzhou 350000, Fujian, China2. Department of Respiratory Medicine, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

Objective： To discuss the effect of signal transducer and activator of transcription 4 (STAT4) in bacteria-lipopolysaccharide (LPS) induced acute lung injury (ALI) on mice.Methods： Mice with gene STAT4 knocked out (STAT4-/-) were used. In the models of LPS induced ALI model, arterial blood gas analysis was utilized, and change of myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) and regulator CD4+CD25+Treg cells were observed using flow cytometry. Pulmonary inflammatory cells were analyzed by Wright stain.Results： In the models of LPS induced ALI, lung injury was alleviated in STAT4-/-mice compared to wild type (WT) mice. PaO2/FiO2was higher, histological score was lower, lung wet/dry ratio decreased, MDSCs and CD4+CD25+Treg cells were increased, total number of inflammatory cells and neutrophils were higher in STAT4-/-mice compared to WT mice (P<0.05).Conclusions： Deficiency of STAT4 could alleviate LPS induced ALI. The potential mechanism may be associated with increased ratios of MDSCs and CD4+CD25+Treg cells in the blood.

signal transducer and activator of transcription 4; lipopolysaccharide; lung injury

R 655.3

A

2017-07-21 [接受日期] 2017-08-17

国家自然科学基金(81500058)，上海市卫生和计划生育委员会课题(15GWZK0102)，上海市公共卫生三年行动计划重点学科建设项目传染病与卫生微生物学(2016/01-2017/12)，福建省自然科学基金面上项目(2017J01140). Supported by National Natural Science Foundation of Youth Science Fund Project (81500058), Shanghai Municipal Health and Family Planning Commission (15GWZK0102), Shanghai City Public Health Three-Year Action Plan for Key Discipline Construction of Infectious Diseases and Health Microbiology (2016/01-2017/12) , and Natural Science Foundation Project of Fujian Province (2017J01140).

刘 歆，硕士，主治医师. E-mail: liuxinxigua@163.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64041990, E-mail: follow_the_line@163.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170616