Bx亚型1例血清学与分子生物学分析

乔郑磊， 戎瑞明， 吴擘颋， 陆 琼， 蒋 密*

1.复旦大学附属中山医院输血科，上海 200032 2.复旦大学附属中山医院上海市器官移植重点实验室，上海 200032 3.上海市血液中心，上海 200051

研究简报

Bx亚型1例血清学与分子生物学分析

乔郑磊1， 戎瑞明2， 吴擘颋1， 陆 琼3， 蒋 密1*

1.复旦大学附属中山医院输血科，上海 200032 2.复旦大学附属中山医院上海市器官移植重点实验室，上海 200032 3.上海市血液中心，上海 200051

ABO血型；Bx亚型；正反定型不符

输血是现代医疗中重要的救治手段之一，正确的血型鉴定在输血工作中有极其重要的意义。ABO血型有多个亚型[1-2]。若血清学显示ABO血型正反定型不符及抗原性减弱，很容易造成忽视和漏检，给临床血型鉴定、交叉配血及器官移植等带来极大的困扰，给临床输血带来危险。最近我们在临床送检样本中发现了1例正反定型不符的样本，并对其进一步做血清学以及基因测序分析，最终确定为Bx亚型，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 患者女性，68岁，汉族，2014年12月14日开始无明显诱因出现胸闷不适伴心前区隐痛，经检查确认为主动脉夹层，2014年12月26日入院准备手术治疗。

1.2 试剂与仪器 微柱凝胶卡：ABO正定型(Biorad，批号：50053.71.09，美国)，ABO反定型(Grifols，批号：71351116024011841，瑞典)；低离子抗人球蛋白凝胶卡(Biorad，批号：500531.07.15，瑞典)；标准细胞ABO(上海血液生物医药有限责任公司，批号：20145327)，抗体筛选细胞(上海血液生物医药有限责任公司，批号：20147829)。抗-A、抗-B(上海血液生物医药有限责任公司，批号：20145120)，人源抗-A、抗-B(上海市血液中心自制)，ABO正定型采用IH-1000全自动血型仪(Biorad，AHC973A，美国)，ABO反定型采用WADiana全自动配血仪(Grifols，ACC73A，瑞典)。

1.3 血清学试验

1.3.1 血型鉴定 初次血型鉴定中ABO正定型采用IH-1000全自动血型仪，ABO反定型采用WADiana全自动配血仪。试管法按文献[3]方法进行，应用筛选细胞和一组试剂谱细胞进行抗体筛选和抗体鉴定，明确或排除不规则抗体。

1.3.2 吸收放散试验 取2 mL患者红细胞，用0.9%氯化钠溶液洗涤3次。取等体积的抗A与抗B血型定型试剂，与压积红细胞混合，4℃吸收1 h，将压积红细胞用足量的4℃ 0.9%氯化钠溶液充分洗涤5次，取最后1次洗液2滴，分别加入4% A1细胞与B细胞，离心观察。将吸收后的压积红细胞加1 mL 0.9%氯化钠溶液，于56℃水浴中放散10 min，期间轻轻振荡1 min，1 000×g离心1 min。取放散液各2滴，分别加入4%A1细胞与B细胞，振荡混匀，1 000×g离心1 min，观察结果。

1.4 基因组DNA提取 采用天根生化科技(北京)有限公司DNA提取试剂盒快速抽取基因组DNA。紫外分光光度计检测DNA浓度。

1.5 外显子6、7扩增与测序 采用的引物按照Olsson等[4]的设计(表1)，均由上海生物工程公司合成。PCR反应体系包括：dNTP终浓度为400 μmol/L、Mg2+终浓度为2.5 μmol/L、10×PCR缓冲液5 μL、Taq酶终浓度为0.5 U、模板DNA终浓度为100～300 ng/L、引物终浓度为0.1 μmol/L，终反应体系为50 μL。PCR反应在PE 9600扩增仪上进行，循环参数为：95℃ 10 min，94℃ 60 s，63℃ 90 s，72℃ 60 s，10个循环；94℃ 60 s，61℃ 90 s，72℃ 60 s，25个循环；72℃ 10 min，4℃保存。10 μL产物经2%琼脂糖电泳鉴定产物的特异性。扩增产物经TaKaRa DNA Fragment Purification Kit[宝生物工程(大连)有限公司]纯化，然后送上海生工生物工程公司测序。并分别以A101、B101、O101等位基因序列作对照，按照文献[5]中的方法进行结果分析。

表1 第6、7号外显子引物序列

2 结 果

2.1 血清学试验结果 见表2。

表2 血型血清学试验结果

2.2 吸收放散试验结果 放散液与标准B细胞反应强度为1+S，与O细胞不反应，表明患者红细胞的放散液中有抗-B抗体存在，证实其细胞表面存在B抗原。

2.3 H抗原强度比较 患者细胞与标准B细胞、标准O细胞的抗-H反应强度依次为：标准O细胞(4+)、患者细胞(3+)、标准B细胞(2+)。

2.4 基因测序结果 ABO基因测序结果显示，外显子6出现261 G缺失与297 A>G两个突变位点。外显子7出现526 C>G，646 T>A，657 C>T，681 G>A，703 G>A，771 C>T，796 C>A，803 G>C，905 A>G，930 A>G，1 096 G>A共11个突变位点(图1)。

图1 第7号外显子基因测序图

3 讨 论

B亚型是正常ABO抗原以外的抗原较弱的亚型或变异型，主要有B3、Bw、Bel、Bx等共9种亚型[4]。B亚型的产生主要是由于半乳糖转移酶第7外显子某些碱基发生缺失或者替换，导致半乳糖转移酶活性降低或者改变，从而导致红细胞表面B抗原数量减少。B亚型血清学的主要特征是：与抗B发生不凝集或弱凝集，而与抗AB凝集，红细胞能吸附和放散抗B抗体[5]。在某些白血病患者中，B抗原可暂时减弱为弱B形式，如同B亚型的表现。本例患者排除血液病，被检患者红细胞与标准A细胞反应强凝集，与抗B反应仅显示较弱的凝集，而与抗A+B出现明显凝集反应，表明患者血清中含有正常的抗A及较弱的抗B；红细胞吸收能力弱于正常人的红细胞，放散能力强于正常红细胞，与抗H反应显示O型类似的强凝集，表明该样本为B亚型。

人类ABO基因定位于第9号染色体上，共有7个外显子，多数编码序列位于第6、7外显子。B等位基因的点突变只是在703、796、803位高度保守。B亚型等位基因除具有703、796、803位高度保守的点突变外，第7外显子还出现新的点突变，如C502T、G539A、G871A、C873G、C1036G、A1037T、C1054T、G1055A等[6-7]。目前发现的Bx亚型有9种[8]，分别为Bx01～09，其主要的突变点为 Bx01：871 G>A；Bx02：905 A>G；Bx03：541 T>C；Bx04：588 C>G；Bx05：976 G>T；Bx06：900 G>C；Bx07：808 T>A；Bx08：550 G>A；Bx09：889 G>A。对第6和第7外显子进行扩增测序，测序结果显示：第6外显子出现261G缺失与297 A>G两个突变位点，表明该标本为BO基因杂合。第7外显子直接测序出现526 C>G、646 T>A、657 C>T、681 G>A、703 G>A、771 C>T、796 C>A、803 G>C、905 A>G、930 A>G、1096 G>A，表明该标本为Bx02与O02的杂合。

Bx亚型是ABO血型中B型红细胞上抗原量减少所致，往往容易被误定为O型。若B亚型患者输入O型血液，或者O型血液的患者输入了B亚型血液，都可能会出现严重的输血反应。由于Bx亚型血液中含有较强的抗B抗体，这类符合输血指征的患者应该考虑给予输注AB型血浆和O型洗涤红细胞[9]。

血型鉴定作为现代输血前检测最关键的步骤之一，其准确的检测结果是确保输血安全的重要保证。当出现正反定型不符时，应该结合血清学及分子生物学方法，正确分析血型，以免漏检亚型，进而确保临床输血安全。

[1] LAZAR T.Human blood groups : chemical and biochemical basis of antigen specificity[J].Transfusion,2001,41(8):1077.

[2] SCHENK-BRUNNER H.ABO(H) system[M].2nd ed, New York:Springer,2000:118-161.

[3] 中华人民共和国卫生部.中国输血技术操作规程(血站部分)[M].天津:科学技术出版社,1997:62-64.

[4] OLSSON M L, CHESTER M A.Polymorphisms at the ABO locus in subgroup A individuals[J].Transfusion, 1996,36(4):309-313.

[5] CHESTER M A, OLSSON M L.The ABO blood group gene: a locus of considerable genetic diversity[J].Transfus Med Rev, 2001,15(3):177-200.

[6] 喻 琼, 吴国光, 梁延连, 等.一个中国汉族ABO血型B亚型家系中发现新的B等位基因[J].中华医学遗传学杂志,2005,22(2):129-133.

[7] 涂源泉, 郭 萍, 罗 臻, 等.Bx亚型1例临床分析[J].临床和实验医学杂志,2010,9(15):1174.

[8] 刘 伟, 李代红, 刘 纯.Bx亚型1例的分子生物学鉴定[J].中南大学学报(医学版),2011,36(12):1213-1216.

[9] SIMON T L, SNYDER E L, SOLHEIM B G, et al.Rossi’s Principles of Transfusion Medicine[M].4th ed.Oxford: Blackwell Publishing Ltd, 2009.

[本文编辑] 廖晓瑜， 贾泽军

Serological and molecular biological studies of Bx subtype: case report

QIAO Zheng-lei1, RONG Rui-ming2, WU Bo-ting1, LU Qiong3, JIANG Mi1*

1.Department of Blood Transfusion, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China 2.Shanghai Key Laboratory of Organ Transplantation, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China 3.Shanghai Blood Center, Shanghai 200051, China

ABO blood group; Bx subtype; blood typing discrepancy

2016-08-08[接受日期]2016-09-13

乔郑磊，硕士，技师.E-mail: qiao.zhenglei@zs-hospital.sh.cn

*通信作者(Corresponding author).Tel: 021-64041990-2829, E-mail: jiang.mi@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160791

R 457.1+1

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