胰腺癌细胞纳米探针的磁共振荧光双模态成像及抗肿瘤效果观察

刘峰君， 叶　雯， 何欣源， 施裕新

上海市公共卫生临床中心, 上海　201508



·论著·

胰腺癌细胞纳米探针的磁共振荧光双模态成像及抗肿瘤效果观察

刘峰君， 叶雯， 何欣源， 施裕新*

上海市公共卫生临床中心, 上海201508

目的： 探讨QDs@Gd-RGD纳米探针用于MIA Ⅱ胰腺癌细胞磁共振(MRI)荧光双模态成像的效果及其对胰腺癌细胞的抑制作用。方法： 构建QDs@Gd-RGD纳米探针，将溶于磷酸盐缓冲液(PBS)的QDs@Gd-RGD纳米探针(QDs@Gd-RGD组)、Gd(Gd组)分别与MIA Ⅱ胰腺癌细胞共孵育1 h，Control组不做处理，然后用荧光相差显微镜及1.5 T MRI仪观察3组的成像特点。3组MIA Ⅱ胰腺癌细胞培养24 h后，观察细胞形态、增殖、克隆、迁移、细胞周期、凋亡的变化。结果： 荧光相差显微镜下观察发现，QDs@Gd-RGD纳米探针分布于MIA Ⅱ胰腺癌细胞膜，而Gd组及Control组细胞膜及细胞内未观察到荧光分布；1.5 T MRI成像显示，QDs@Gd-RGD组信号强度明显高于Gd组、Control组(P<0.05)。QDs@Gd-RGD组MIA Ⅱ胰腺癌细胞失去典型铺路石样形态、细胞核碎裂、细胞质空泡化，细胞克隆能力明显下降，细胞增殖抑制，细胞迁移能力减弱，细胞周期明显被阻滞，细胞凋亡增加(P<0.05)。结论： QDs@Gd-RGD纳米探针用于MIA Ⅱ胰腺癌细胞MRI荧光双模态成像的效果较好；QDs@Gd-RGD纳米探针体外对MIA Ⅱ胰腺癌细胞有一定的杀伤作用。

胰腺癌细胞；QDs@Gd-RGD；MRI荧光双模态成像；靶向诊断；抗肿瘤治疗

胰腺癌发病较隐匿，早期诊断及治疗比较困难，而且近年来胰腺癌的发病率及死亡率均逐年升高[1-3]。将新型纳米医学影像对比剂[4-6]与影像技术和荧光成像技术结合，即MRI荧光双模态分子成像，成为近年来胰腺癌靶向诊断及治疗的一种新方法。QDs@Gd-RGD纳米探针能在胰腺癌细胞和分子水平进行MRI荧光双模态分子成像的定性分析，并能同时观察分子探针对细胞的影响。

RGD多肽是一类含有Arg-Gly-Asp的短肽，能拮抗αvβ3整合素[7-8]受体，进而介导细胞外基质与细胞及细胞与细胞之间的作用。研究[9-10]表明，αvβ3在肿瘤组织及肿瘤细胞中表达增加。 研究[11-13]表明，RGD多肽能诱导肿瘤细胞凋亡，在肿瘤靶向治疗中发挥重要作用。因此，RGD多肽可作为特异性靶向标志物用于胰腺癌MRI荧光双模态分子成像，还可作为αvβ3整合素受体拮抗剂抑制肿瘤生长，从而同时达到靶向诊断和治疗的目的。

本实验通过构建含QDs@Gd-RGD的纳米探针，使其结合于表达αvβ3受体的MIA Ⅱ胰腺癌细胞表面，探讨QDs@Gd-RGD纳米探针用于胰腺癌细胞MRI荧光双模态分子成像的效果及其对胰腺癌细胞生长及活性的影响，为在体胰腺癌肿瘤MRI荧光双模态分子成像和药物靶向治疗提供实验依据。

1　材料和方法

1.1主要材料及试剂MIA Ⅱ胰腺癌细胞株由上海市第十人民医院消化内科惠赠；DMEM细胞培养液、胎牛血清及双抗购自上海锐金生物医药科技有限公司；荧光倒置相差显微镜(DMI6000B)购自德国Leica公司；1.5 T MRI仪购自荷兰Philips公司；RGD多肽购自上海楚肽生物科技有限公司。

1.2QDs@Gd-RGD纳米探针合成将量子点采用PMAO和ED-600进行双亲性表面改性，使其由亲油性转变为亲水性[14]。将5.0 nmol亲水性量子点与500 nmol DOTA-NHS在1.0 mL硼酸盐缓冲液中充分反应后，超速离心纯化(100 000×g)，得到的QDs-DOTA纳米颗粒用1.0 mL 磷酸盐缓冲液(PBS，10 mmol/L)分散。称取500 nmol 醋酸钆，溶解于1.0 mL去离子水中后，缓慢滴加到含QDs-DOTA纳米颗粒PBS溶液中，使QDs-DOTA与Gd3+充分螯合后超速离心纯化(100 000×g)，得到的颗粒分散在硼酸盐缓冲液(50 mmol/L)中。将QDs@Gd3+、RGD、EDC按照摩尔比1∶10∶4 000于室温反应2.0 h后离心(100 000×g)得到QDs@Gd3+-RGD双模态纳米探针。合成的QDs@Gd-RGD纳米探针的尺寸、形态学特征、光谱学表征及弛豫性参见文献[15]。

1.3细胞培养与分组将MIA Ⅱ胰腺癌细胞株用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养液在5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱中培养。将细胞传代后培养于24孔板，分成QDs@Gd-RGD组、Gd组、Control组，每组设3个复孔。前两组分别加入100 μL含QDs@Gd-RGD纳米探针(40 μmol/L)、Gd (40 μmol/L)的PBS，Control组不做处理。共孵育1 h后于荧光相差显微镜下观察，并进行MRI成像。1.4荧光相差显微镜及MRI成像将3组细胞用PBS洗涤3～5次，镜下观察MIA Ⅱ胰腺癌细胞荧光分布情况。另将3组细胞用PBS洗涤3～5次，0.25%胰蛋白酶消化3～5 min，胎牛血清终止消化，然后用15 mL离心管离心5 min (150×g)，去除上清液，加入3 mL PBS洗涤，离心5 min (150×g)，于DMEM培养液中轻轻吹打成均匀的细胞悬液，置于2 mL Eppendorf管中行MRI扫描。采用1.5 T MRI进行T1WI序列扫描(20 s)，扫描条件为层厚5 mm、层距0.3 mm、TR/TE=2 000/120 ms、矩阵256×256、FOV：20×9.1。

1.5细胞增殖的观察采用CCK-8法分析细胞增殖情况。将3组细胞分别接种于96孔板，在5%CO2、饱和湿度、37℃温箱培养24 h后，用PBS反复洗3～5次。前两组分别加入100 μL含QDs@Gd-RGD纳米探针(40 μmol/L)、Gd (40 μmol/L)的PBS，Control组不做处理。培养24 h后取出培养箱，加入10 μL CCK-8 (5 mg/mL)，孵育4 h后，用多功能酶标仪测量 (Infinite M200 Pro, 瑞士Tecan 公司)测定D490值。

1.6细胞形态及细胞克隆3组细胞培养24 h后，用PBS反复冲洗3～5次，在荧光相差显微镜下观察MIA Ⅱ胰腺癌细胞形态。然后，各组分别取200个细胞于培养板培养，7 d后，用PBS反复洗3～5次，用乙醇固定后加入结晶紫染色，再用PBS反复洗3～5次，拍照。显微镜下计数细胞的克隆数，计算克隆形成率，克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。

1.7细胞迁移将3组细胞在5%CO2、饱和湿度、37℃温箱培养24 h后，用PBS反复洗涤3～5次，用胰酶消化3～5 min，胎牛血清终止消化，然后离心5 min(150×g)，去除上清液，加入3 mL PBS洗涤后离心5 min(150×g)，去除上清液，加入培养液吹打成细胞悬液，置于Transwell板上室。24 h后，用乙醇棉球擦拭上室，固定10 min，加入结晶紫染色，用PBS反复洗涤3～5次，拍照。每组随机选取5个放大倍数为200的视野，计算每组平均细胞数。细胞迁移百分数=迁移细胞数/细胞总数×100%。

1.8细胞周期及细胞凋亡将3组细胞在5%CO2、饱和湿度、37℃温箱培养24 h后，用PBS反复洗涤3～5次，胰酶消化3～5 min，胎牛血清终止消化，然后离心5 min(150×g)，去除上清液，加入3 mL PBS洗涤，离心(150×g)，去除上清液，用培养液吹打成细胞悬液，加入相应抗体，在流式细胞仪上检测细胞周期及凋亡情况。

1.9统计学处理应用SPSS 17.0软件包进行统计。各组间比较采用多组独立样本的单因素方差分析，双侧检验。检验水准(α)为0.05。

2　结　果

2.1QDs@Gd-RGD MRI荧光双模态成像QDs@Gd-RGD与MIA Ⅱ胰腺癌细胞作用1 h后，进行荧光及MRI成像。在荧光相差显微镜下观察，发现QDs@Gd-RGD纳米探针分布于MIA Ⅱ胰腺癌细胞膜(环形红色荧光)，Gd组及Control组细胞未见明显荧光(图1A)。MRI成像显示，QDs@Gd-RGD组MIA Ⅱ胰腺癌细胞的T1WI信号强度明显高于Gd组及Control组(图1B)；QDs@Gd-RGD组MIA Ⅱ胰腺癌细胞的T1WI信号弛豫率明显高于Gd组及Control组(P<0.05，图1C)。

2.2QDs@Gd-RGD的抗肿瘤作用

2.2.1细胞增殖培养24 h后，QDs@Gd-RGD组MIA Ⅱ胰腺癌细胞增殖抑制较其他两组明显(P<0.05，图2)。

2.2.2细胞形态及细胞克隆培养24 h后，QDs@Gd-RGD组细胞失去典型铺路石样形态，细胞核碎裂，细胞质空泡化(图3A)。培养板培养7 d后，QDs@Gd-RGD组MIA Ⅱ胰腺癌细胞的克隆数量最少(图3B)；QDs@Gd-RGD组MIA Ⅱ胰腺癌细胞相对克隆形成率明显低于Gd组及Control组(P<0.05，图3C)。

图1　3组MIA Ⅱ胰腺癌细胞的荧光及磁共振成像

图2　CCK-8法分析3组MIA Ⅱ胰腺癌细胞的增殖情况

图3　3组MIA Ⅱ胰腺癌细胞的形态及克隆

2.2.3细胞迁移QDs@Gd-RGD组MIA Ⅱ胰腺癌细胞迁移到Transwell板下室的细胞数量较其他两组少(图4A)，提示QDs@Gd-RGD纳米探针减弱了肿瘤细胞的迁移能力。QDs@Gd-RGD组MIA Ⅱ胰腺癌细胞的迁移能力明显弱于Gd组及Control组(P<0.05，图4B)。

图4　3组MIA Ⅱ胰腺癌细胞的迁移能力

2.2.4细胞周期培养24 h后，QDs@Gd-RGD组MIA Ⅱ胰腺癌细胞G2+M期阻滞较其他两组更明显(P<0.05)，说明QDs@Gd-RGD纳米探针影响MIA Ⅱ胰腺癌细胞的细胞周期，使大部分细胞停留在G2+M期(图5)。

图5　流式细胞检测示3组的MIA Ⅱ胰腺癌细胞周期改变

2.2.5细胞凋亡培养24 h后，QDs@Gd-RGD组MIA Ⅱ胰腺癌细胞晚期的凋亡率大于其他两组(P<0.05，图6)。

图6　3组MIA Ⅱ胰腺癌细胞的凋亡情况

3　讨　论

早期检出及早期治疗胰腺癌是提高生存率、降低死亡率的关键。随着对疾病的认识从组织和细胞水平深入到分子、基因水平，近年来分子影像逐渐成为研究的热点。随着MRI成像及纳米技术的发展，将两者相结合的分子影像应用逐渐增多。此外，通过纳米技术可将具有不同成像单元集成在一个纳米载体上，合成具有双或多模态成像功能的纳米探针。

文献[15-19]报道，RGD多肽作为肿瘤的潜在靶标，结合分子影像技术，将在肿瘤的早期诊治、疾病监测方面发挥重要作用。肿瘤组织的新生血管中有大量αvβ3表达，而RGD多肽能拮抗αvβ3整合素受体，具有一定的肿瘤抑制作用。本实验构建了弛豫性及结合效率良好的QDs@Gd-RGD纳米探针，在体外进行胰腺癌细胞MRI荧光双模态分子成像，并探讨该探针对肿瘤细胞的杀伤作用。结果显示，QDs@Gd-RGD纳米探针能与MIA Ⅱ胰腺癌细胞膜结合，显示环形红色荧光，并能显著增强胰腺癌细胞的MRI信号，为在体胰腺癌靶向显像提供了实验依据。

此外，研究[20]发现，外源性RGD多肽与肿瘤细胞膜表达的αvβ3结合后，可从多个环节发挥对肿瘤的抑制作用。研究[21]表明，RGD多肽配体与αvβ3受体结合后，阻滞细胞周期，导致肿瘤细胞凋亡。本研究也表明，QDs@Gd-RGD纳米探针会导致MIA Ⅱ胰腺癌失去典型铺路石样形态、细胞核碎裂、细胞质空泡化，细胞克隆能力明显下降，细胞增殖抑制，细胞迁移减弱，细胞周期阻滞，细胞凋亡增加。由此推论，QDs@Gd-RGD纳米探针对肿瘤细胞有一定杀伤作用。

综上所述，QDs@Gd-RGD纳米探针不仅能用于MIA Ⅱ胰腺癌细胞MRI荧光双模态分子成像，还能抑制肿瘤细胞的活性。结果提示，QDs@Gd-RGD可作为胰腺癌MRI荧光双模态分子成像和药物靶向治疗的潜在纳米探针。

[1]Tsujimoto H, Morimoto Y, Takahata R, et al. Photodynamic therapy using nanoparticle loaded with indocyanine green for experimental peritoneal dissemination of gastric cancer[J]. Cancer Sci,2014,105(12): 1626-1630.

[2]Shin JU, Lee JK, Kim KM, et al. The differentiation of autoimmune pancreatitis and pancreatic cancer using imaging findings[J].Hepatogastroenterology, 2013,60(125): 1174-1181.

[3]Chakraborty S, Baine MJ, Sasson AR, et al. Current status of molecular markers for early detection of sporadic pancreatic cancer[J]. Biochim Biophys Acta, 2011, 1815(1): 44-64.

[4]Lin G, Wang X, Yin F, et al. Passive tumor targeting and imaging by using mercaptosuccinic acid-coated near-infrared quantum dots[J]. Int J Nanomedicine, 2015,10: 335-345.

[5]卢晓莉, 张俊, 王峰, 等.68Ga-DOTA-NOC胰腺癌生长抑素受体靶向显像的实验研究[J]. 中华核医学与分子影像杂志, 2013, 33(5): 372-376.

[6]Li D, Zhou B, Zhang B, et al. Construction and validation of dual fusion reporter gene expression vector for molecular imaging study[J]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 2011,91(47): 3363-3366.[7]郑媛媛,王继红,李庆伟.以整合素αvβ3为靶点的RGD配体在抗肿瘤血管新生中的应用[J].中国生物化学与分子生物学报,2013,29(4):299-305.

[8]Salvo E, Garasa S, Dotor J, et al. Combined targeting of TGF-β1and integrin β3impairs lymph nodemetastasis ina mouse model of non-small-cell lung cance[J].Mol Cancer, 2014, 13: 112.

[9]Xu Y, Xu J, Shan W , et al.The transport mechanism of integrin αvβ3 receptor targeting nanoparticles in Caco-2 cells[J]. Int J Pharm, 2016,500(1-2): 42-53.

[10]李燕敏, 王新玲, 李淑芳,等. HIF-1α、整合素αvβ3与脑胶质瘤血管生成相关性研究[J]. 中华神经外科杂志, 2013, 29(8): 834-837.

[11]黄榕权,龙捷,张惠球,等. 短肽RGDSY-CTTHWGFTLC对乳腺癌细胞转移和增殖的影响[J]. 南方医科大学学报, 2013, 33(9): 1367-1371.

[12]孙录, 戴维群，王华. 含RGD的细胞粘附肽抑制人胃癌细胞BGC823增殖及诱导其凋亡作用[J]. 中国实验诊断学, 2011, 15(3): 392-396.

[13]Chen H, Niu G, Wu H, et al.Clinical application of radiolabeled RGD peptides for PET imaging of integrin αvβ3[J]. Theranostics, 2016,6(1): 78-92.

[14]Lees EE, Nguyen TL, Clayton AH, et al. The preparation of colloidally stable, water-soluble, biocompatible, semiconductor nanocrystals with a small hydrodynamic diameter[J].ACS Nano, 2009, 3(5):1121-1128.

[15]刘峰君, 张兵波, 宋歌, 等. Gd3+与RGD共修饰量子点用于胰腺癌细胞的荧光及MR双模态成像[J]. 高等学校化学学报, 2012, 33(2): 378-382.

[16]Yan Y, Chen K, Yang M, et al. A new 18F-labeled BBN-RGD peptide heterodimer with a symmetric linker for prostate cancer imaging[J]. Amino Acids, 2011, 41(2): 439-447.

[17]刘莹莹，徐金锋，严飞，等. Integrin αvβ3 靶向超声微泡的制备及体外寻靶实验[J]. 中国医学影像技术, 2016,32(2): 175-178.[18]Sai KK, Huang C, Yuan L, et al.18F-AFETP,18F-FET, and18F-FDG imaging of mouse DBT gliomas[J]. J Nucl Med, 2013,54(7): 1120-1126.

[19]Liu S, Liu H, Jiang H, et al. One-step radiosynthesis of18F-AlF-NOTA-RGD 2 for tumor angiogenesis PET imaging[J]. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2011,38(9): 1732-1741.

[20]冯佳鹏，鲁建光. RGD序列合成肽抑制喉癌细胞增殖的实验研究[J].哈尔滨医科大学学报,2010,44(3):212-216.

[21]马成云，王华，严明兰，等. 细胞黏附肽抑制人胃癌细胞BGC823生长及诱导其凋亡作用[J].吉林大学学报:医学版, 2009, 35(3):478-481.

[本文编辑]姬静芳

Effects of QDs@Gd-RGD nano probe on MRI and fluorescent dual-modality imaging of pancreatic cancer cellsand its anti-tumor role

LIU Feng-jun, YE Wen, HE Xin-yuan, SHI Yu-xin*

Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai 201508, China

Objective： To investigate the effects of QDs@Gd-RGD nano probe on fluorescent and MRI dual-modality imaging of MIA Ⅱ pancreatic cancer cells and its role in inhibiting pancreatic cancer cells. Methods： QDs@Gd-RGD nano probe was prepared. QDs@Gd-RGD nano probe (QDs@Gd-RGD group) and Gd (Gd group) were dissolved in phosphate buffer solution (PBS) and incubated with MIA Ⅱ pancreatic cancer cells for 1 h, and no treatment was given to the control group. And then imaging characteristics of the 3 groups were observed by fluorescence phase contrast microscope and 1.5 T MRI observation. After 3 groups of MIA Ⅱ pancreatic cancer cells were cultured for 24 h, cell morphology, proliferation, cloning, migration, cycle and apoptosis of MIA Ⅱ pancreatic cancer cells were observed. Results： Fluorescence phase contrast microscopy showed that the QDs@Gd-RGD nanoparticles were distributed in MIA Ⅱ pancreatic cancer cell membrane, while no cell membrane and cell fluorescence distribution was observed in the Gd group and the control group. 1.5 T MRI imaging showed that the signal intensity of QDs@Gd-RGD group was significantly higher than that of the Gd group and the control group (P<0.05). QDs@Gd-RGD group MIA Ⅱ pancreatic cancer cells lost the typical paving-stone morphology, nuclear fragmentation and cytoplasmic vacuolization took place, cell cloning ability decreased significantly, cell proliferation was inhibited, cell migration ability decreased, cell cycle was significantly blocked and cell apoptosis increased (P<0.05). Conclusions： QDs@Gd-RGD nano probe is effective in fluorescence and MRI dual modality imaging of MIA Ⅱ pancreatic cancer cells. Meanwhile, QDs@Gd-RGD nano probe has a certain killing effect on MIA Ⅱ pancreatic cancer cells.

pancreatic cancer cell; QDs@Gd-RGD; MRI and fluorescent dual-modality imaging; targeted diagnosis; anti-tumor therapy

2016-06-06[接受日期]2016-07-01

上海市科学技术委员会上海市自然基金青年项目(13ZR1459400). Supported by the Program of Science and Technology Commission of Shanghai Municipal for Young Scientists (13ZR1459400).

刘峰君，硕士，主治医师. E-mail: liufengjun121@126.com

Corresponding author). Tel: 021-37990333, E-mail: shiyuxin@shaphc.org

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160671

R 735.9

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