水溶性番茄浓缩物经自噬途径调控血小板的氧化损伤

李孔耀，施译琳，马熙麟，田泽众，邹进超，王锐杰，毛钰蘅，杨 燕

（1.中山大学公共卫生学院（深圳），广东深圳 518106；2.广东省营养膳食与健康重点实验室，广东广州 510080；3.广东省营养转化工程技术研究中心，广东广州 510080；4.中山大学公共卫生学院，广东广州 510080）

血小板是巨核细胞来源的无核血细胞，具有止血、凝血的基本生理功能［1］。线粒体在血小板的代谢和活化中发挥主要作用，线粒体损伤是血小板损伤的重要标志［2］。已有研究发现，部分心血管疾病（cardiovascular diseases，CVD）患者的机体氧化水平升高，血小板内活性氧（reactive oxygen species，ROS）增加，导致血小板线粒体氧化损伤［3］。因此推测，抑制血小板的氧化损伤可能是防治CVD 的有效手段之一。自噬是溶酶体降解双膜泡中受损蛋白和细胞器的过程，可以通过细胞内自噬体形成清除受损线粒体［4］，生理性自噬有助于细胞新陈代谢和某些细胞器更新［5］。此外，在过氧化条件下，自噬具有促进细胞生存的作用［4，6］，例如，糖尿病患者的血小板在过氧化状态下增强自噬，清除部分ROS 和受损线粒体，可保护血小板免受氧化损伤［7-8］。此外，LC3 I 与磷酸二乙醇胺结合产生LC3 Ⅱ的过程与自噬小体形成有关，因此LC3 Ⅱ/Ⅰ的比值大小可以用来评估自噬水平的高低［4］。膳食营养素干预对于早期防治CVD 发挥着重要作用［9］。流行病学研究表明，膳食摄入番茄可降低心血管疾病的发生率［10］。水溶性番茄浓缩物（Fruitflow）是使用物理方法除去番茄中的脂溶性成分，并将水溶性成分浓缩而得到的。人群及体外研究表明Fruitflow 对血小板具有降低聚集、活化的作用［11-12］。并且，Fruitflow 及其主要的成分具有抗氧化作用［13-14］，然而它对血小板氧化损伤的作用仍不清楚，对血小板自噬的影响也未见报道。因此，本研究拟采用体外实验，探讨Fruitflow 对H2O2导致的血小板氧化损伤的影响，及血小板自噬在其中可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象

招募符合条件的健康志愿者：年龄25～40 岁，两周内未曾服用会改变血小板、凝血系统功能的药物或营养补充剂（辅酶Q10、鱼油等）；志愿者出现以下任何一种情况将予以排除，包括近半年患有心血管疾病、肿瘤等病史；或者吸烟、酗酒半年以上。研究经中山大学公共卫生学院伦理委员会审批，并依照赫尔辛基宣言进行，参与者对试验方案知情同意。

1.2 主要试剂

Fruitflow 粉末获自汤臣倍健公司；过氧化氢（Hydrogen peroxide，H2O2）和2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（2′，7′-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate，DCFH-DA）购自美国Sigma 公司；四甲基罗丹明甲酯（Tetramethylrhodamine methyl ester，TMRM）、一抗LC3 B 和二抗goat anti-rabbit、goat antimouse 购自英国abcam 公司；一抗phospho-p53（serine 15）、p53、p62、β-actin 购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.3 主要仪器与设备

多功能酶标仪美国Bio Tek 公司；流式细胞仪CytoFlex S 美国Beckman Coulter 公司；Tanon 5200发光成像系统中国Tanon公司。

1.4 方 法

1.4.1 制备纯化血小板 清晨，对空腹志愿者用一次性静脉采血针（0.7 mm×25 mm）从肘静脉抽取15 mL 的血液，注入含柠檬酸钠（1：9）的真空抗凝管中，离心（300×g，10 min，22 ℃），取上清为富血小板血浆。用Sepharose 2B 柱在PIPES（1L 溶液含PIPES 粉末8.38 g、NaCl 8.01 g、KCl 0.298 g 和葡萄糖1 g，pH 7.0）缓冲液中制备纯化血小板，详见已发表文献［15］。

1.4.2 测定血小板线粒体膜电位 用不同剂量（0、20、40、80 mg/L）的Fruitflow 或溶剂对照与纯化血小板在体外共同孵育30 min 后，离心弃上清，并重悬，加入H2O2（1 mmol/L）或溶剂对照继续孵育40 min，孵育完成后，加入终浓度为400 nmol/L 的TMRM，迅速混匀，避光孵育20 min，流式细胞仪测定血小板线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，ΔΨm）水平，CytExpert 2.3分析。

1.4.3 测定血小板ROS 生成水平 纯化后的血小板（1×106个/mL）与10 μmol/L 的DCFH-DA 共避光孵育30 min，离心弃上清，并重悬。用80 mg/L 的Fruitflow 或溶剂对照与纯化血小板共孵育30 min，然后加入H2O2或溶剂对照，和3-MA（2 mmol/L）或溶剂对照，避光孵育60 min。收集细胞，用荧光微孔板检测，在488 nm 处激发样品，在525 nm 处测定荧光强度。

1.4.4 Western blot 收集Fruitflow 与H2O2处理后的血小板，并离心（12 000×g，4 ℃，15 min），得到细胞沉淀，加入混有（100：1）蛋白酶抑制剂的裂解液，冰上裂解30 min，再次离心（12 000 ×g，4 ℃，15 min）取上清即为血小板蛋白。用BCA 试剂盒测定蛋白浓度，加入上样缓冲液，混匀，制样后-20 ℃保存。将样本进行电泳、转膜、封闭，用对应的一抗（Phospho-p53、p53、p62、LC3 B、β-actin）4 ℃过夜孵育，洗膜，二抗常温孵育。ECL 化学发光后成像仪成像，用Quantity one 计算灰度值。实验至少重复3次。

1.5 统计学分析

数据资料用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 5.0软件分析和绘制统计图。图中的计量资料用均数±标准误（standard error of mean，SEM）表示；采用单因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）进行多组间比较，方差分析差异有统计学意义时两两比较采用Bonferroni 法，双侧P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Fruitflow对H2O2诱导的血小板损伤的影响

与单纯H2O2组相比，40、80 mg/L 的Fruitflow 能显著升高TMRM 阳性血小板水平，这提示Fruitflow具有降低血小板线粒体膜电位去极化的作用，差异具有统计学意义（P＜0.01；图1）。

图1 不同浓度Fruitflow对H2O2诱导的血小板线粒体膜电位去极化的影响Fig.1 Effect of Fruitflow on ΔΨm depolarization in H2O2-treated platelets

2.2 Fruitflow 对H2O2诱导的血小板ROS 生成的影响

H2O2可显著提升血小板内ROS 的水平（P＜0.000 1，图2），这与其他人的研究结果一致［8］。80 mg/L 的Fruitflow 可显著减少H2O2诱导的血小板ROS 生成（P＜0.01；图2）。并且，自噬抑制剂3-MA可以有效的抑制Fruitflow 的这一作用（P＜0.05；图2）。这提示自噬可能在Fruitflow 减轻血小板氧化损伤中起重要作用。

图2 Fruitflow对H2O2诱导的血小板ROS生成的影响Fig.2 Effect of Fruitflow on ROS generation in H2O2-treated platelets

2.3 Fruitflow 降低H2O2诱导的血小板p53 蛋白磷酸化

20、40、80 mg/L 的Fruitflow 对p53 蛋白的表达并没有显著的影响（P＞0.05；图3B）。但是，Fruitflow 可有效抑制H2O2诱导的p53 蛋白磷酸化水平，差异有统计学意义（P＜0.05；图3C）。

图3 Fruitflow 对H2O2导致的血小板p53蛋白磷酸化的影响Fig.3 Effect of Fruitflow on p53 phosphorylation in H2O2-treated platelets

2.4 Fruitflow促进血小板自噬

Western blot 结果显示，与对照组相比，20、40、80 mg/L 的Fruitflow 可以显著促进LC3 ⅠⅠ向LC3Ⅱ转化（P＜0.05；图4A），并降低p62 的表达（P＜0.05；图4 B）。

图4 Fruitflow 对血小板自噬的影响Fig.4 Effect of Fruitflow on autophagy in resting platelets

2.5 Fruitflow对H2O2处理血小板自噬的影响

H2O2可以促进LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ转化，这与其他人的研究结果一致。与单纯H2O2组相比，80 mg/L的Fruitflow 也能显著的促进H2O2诱导的血小板LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ转化（P＜0.05；图5）。

图5 不同浓度的Fruitflow对H2O2促进血小板自噬的影响Fig.5 Effect of Fruitflow on autophagy in H2O2-treated platelets

2.6 Fruitflow 通过促进自噬减轻H2O2导致的血小板损伤

3-MA 可以显著逆转80 mg/L Fruitflow 升高H2O2处理后的血小板线粒体膜电位的效应（P＜0.01；图6）。并且，与3-MA 组相比，加入Fruitflow和3-MA 组的线粒体膜电位差异无统计学意义（P＞0.05；图6）。

图6 Fruitflow，3-MA对H2O2诱导的血小板线粒体膜电位去极化的影响Fig.6 Effect of Fruitflow，3-MA on ΔΨm depolariza⁃tion in H2O2-treated platelets

3 讨论

氧化应激反应是CVD 的一个重要病理机制。例如，在糖脂代谢紊乱、高血压等疾病中，机体处于过氧化状态，从而导致血小板过氧化损伤［16-17］；在这一过程中，血小板线粒体出现功能障碍、损伤［2］；最终引起血小板反应性升高（轻度线粒体损害）和磷脂酰丝氨酸外翻增多（严重线粒体损害）而加速血栓形成［16，18］。并且，体外实验显示用H2O2孵育血小板会直接导致线粒体损伤。已有研究表明1 mmol/L 的H2O2体外诱导血小板ROS 的增加量与糖尿病病人的血小板内ROS 增量相一致，此种H2O2的浓度与其他研究诱导血小板损伤的浓度相一致，因此，本实验采用的H2O2剂量浓度为1 mmol/L［3，8］。本研究发现，Fruitflow 可以抑制H2O2导致的血小板线粒体损伤，这可能与Fruitflow 预防CVD 相关。另外，p53在丝氨酸15位点的磷酸化可直接导致线粒体功能障碍，ROS 是p53 诱导线粒体损伤的早期事件［3］。本研究首次发现Fruitflow 可以减少H2O2导致的ROS 生成和p53（serine 15）磷酸化，从而减轻血小板氧化损伤。有研究表明，膳食营养素在癌细胞中可以促进p53 的表达及磷酸化，但是在正常细胞系中，研究表明绿原酸、芦丁、多酚（白黎芦醇、姜黄素）可以通过抑制氧化应激和p53 磷酸化来发挥细胞保护作用。Fruitflow 的主要成分包括绿原酸、芦丁，因此相关的结果与以往研究相一致［19-20］。然而，Fruitflow 经ROS 调控血小板氧化损伤的具体成分尚不清楚，仍需进一步探讨。

细胞内自噬水平的降低，与CVD 的进展相关［21］。这主要是因为自噬降低，细胞积累错误折叠的蛋白质和功能异常的线粒体，进一步加剧细胞损伤［5］。血小板自噬最早于2014年被报道，随后研究也证实血小板自噬与其功能存在紧密联系［4，7］。当血小板自噬被抑制时，细胞凋亡增加，并且线粒体吞噬作为一种选择性自噬，可以抑制氧化应激或低氧条件下的血小板聚集［4］。本研究发现，Fruitflow可以促进血小板LC3 Ⅱ/Ⅰ比值升高和p62 表达降低，首次证明了Fruitflow 可促进血小板自噬［4］。这提示Fruitflow 可能通过调控自噬，发挥CVD预防作用。据报道，血小板自噬促进细胞存活，特别是自噬通过自噬体形成隔离产生ROS 的受损线粒体［8］。本研究发现，Fruitflow 可增强H2O2处理血小板的自噬。同时，使用自噬抑制剂3-MA 时，Fruitflow 升高H2O2处理血小板的线粒体膜电位被逆转。这表明，Fruitflow 降低血小板内的ROS 可能部分通过自噬小体吞噬受损线粒体。其他研究也表明Fruitflow含有的绿原酸、芦丁可以通过促进自噬，清除受损细胞器，减轻细胞损伤［22-23］。然而，Fruitflow 是否通过自噬调控其他血小板功能仍需进一步研究。此外，血小板自噬表现为吞噬泡、自噬小体、自噬溶酶体的形成，至于Fruitflow 对血小板自噬过程中形态学的影响需要以后进一步研究。

临床研究表明Fruitflow 对血小板功能的抑制作用主要是通过降低GPⅡb/Ⅲa的活化和P-selectin的表达，这与其成分中所含的多酚和核苷具有提高cAMP 和cGMP 水平的潜在作用一致［11］。此外，近期的一项体外研究表明Fruitflow 抑制血小板聚集和活化与调控PI3K/Akt、MAPKs 分子机制相关［24］。然而，这些分子机制是否参与Fruitflow 调控自噬、氧化应激，仍需进一步探究。

Fruitflow 的欧洲食品安全局（European Food Safety Authority）推荐的每日摄入量为150 mg，并且药代动力学实验表明，志愿者摄入150 mg Fruitflow后，产生的最大理论循环浓度约为43 mg/L［11］。因此，我们的体外研究采用20、40、80 mg/L 的剂量，这与之前体外研究用于抑制血小板聚集、活化的浓度相一致［24］。并且，多项人群研究结果表明150 mg/d 的Fruitflow 摄入不会产生肝肾功能损害和影响凝血时间。因此，Fruitflow 具有较好的安全性。

综上所述，本研究表明Fruitflow 可通过促进血小板的自噬功能从而减轻H2O2导致的血小板氧化损伤。因此，本研究为Fruitflow 在心血管疾病的营养膳食干预防治提供了理论依据，具有重要应用价值。